Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Detta arbete har delvis stöd av NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for förhindrande av Blindness (JCC, AAF), fria medel till Ögonkliniken från forskning att förebygga blindhet (RPB), NY och RPB Medical Student Fellowship Grant (JLL).

Ett. Retinal Framställning <ol><li> Enucleate musen ögat. Använda en hand, öppna ögonlocken så att ögat är synlig. Med den andra handen, med en böjd pincett (böjda uppåt), utöva påtryckningar på högre och lägre aspekter av bana förrän Globe sticker. Stäng försiktigt pincett vid den bakre sidan av ögat och lyft i en kontinuerlig rörelse för att enucleate ögat. </li><li> Fix ögat med 10% neutral buffrad formalin under minst 24 tim. </li><li> Placera öga i PBS-lösning i en liten petriskål. </l...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Trypsin Digest är en standardmetod för att bedöma vaskulaturen av näthinnan. Tyvärr är det tekniskt utmanande och kan resultera i hög prov förlust om den inte utförs på rätt sätt. Vidare är förfarandet särskilt svår i möss, vilket kan begränsa tillämpningen av denna teknik i de vanligaste genetiska djurmodeller av ögonsjukdomar. Detta dokument ger vägledning om hur man ska utföra proceduren på ett effektivt och konsekvent i mus ögon. Det finns flera viktiga steg i pro...

Visualisering vaskulaturen av näthinnan är en mycket viktig metod för att dissekera av mekanismen av olika ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati. Det gör att man kan bedöma de tidigaste kärlmissbildningar, inklusive microaneurysms, kapillär degeneration och pericyter förlust 8,9. Hittills har det funnits flera tekniker utvecklats för att analysera retinal kärlsystemet. Perfusion av olika färgämnen har använts för att belysa de fartyg, men alla har delat liknande begränsningar. Injektion belyser sällan hela retinal kärlsystemet inte ges vid ett högt tryck, vilket riskerar att spricka och skada fartyg 1. Immunfärgning av vaskulär endotel med fluorofor-märkta G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugerat, I21413, Invitrogen, 1:100 utspädning) och retinal platta fästen kan belysa den övergripande arkitekturen av fartygen, men utan detaljerad visualisering av kapillärer, basalmembran och pericyter . Det noterades avFriedenwald att fartygen kan belysas genom färgning platt-fästen av näthinnan med periodisk syra-Schiff (PAS) eller hematoxylin och eosin (H &amp; E) färgning 10. Dock var färgning ospecifik för fartygen och betonade icke-vaskulär vävnad också, vilket gör det svårt att skilja fartygen. Under 1960-talet utvecklades Cogan och Kuwabara trypsinet digest teknik som gjorde det lättare att visualisera näthinnan kärlsystemet genom uppslutning av nonvascular komponenterna i näthinnan 1. Sedan dess har trypsin smälta blivit guldmyntfoten metoden att analysera kärlsystemet av näthinnan 2-5. Det är dock viktigt att notera att andra alternativa tekniker för att isolera vaskulaturen har beskrivits. Användningen av osmotisk lys har använts för att isolera vaskulaturen och tillåta biokemiska studier av vävnad 11,12, men förfarandet har inte använts som en primär metod för anatomisk studie. Vävnaden Tryckmetodenanvändes för att isolera stora delar av mikrovaskulatur och ger förmågan att studera electrotonic arkitekturen i vaskulaturen 13. I teorin kan denna teknik också användas för att studera anatomiska förändringar, som kvaliteten på fartygen är hög. Det är dock endast kunde isolera segment av hela vaskulaturen nätverket. Även om dessa metoder inte kan ersätta trypsin smälta, är det viktigt att notera att de har olika fördelar och brister och kompletterar varandra i detta avseende. Den trypsin digest metoden är tekniskt utmanande och är svår att utföra genomgående 6,7. Vidare har det noterats att trypsin digest är särskilt svårt på en musmodell, särskilt om man önskar att upprätthålla den totala vaskulära arkitekturen av näthinnan 6,7. Utmaningar inkluderar (1) over-rötning av näthinnan som orsakar förlust av både kärlsystemet samt icke-vaskulär vävnad, (2) under-matsmältning, kräveromfattande mekanisk dissektion vilket i sin tur kan leda till skador på fartyget sängen, (3) dålig separation av icke-vaskulär vävnad från kärlsystemet vilket leder till icke-specifik färgning. Flera manuskript har markerat dessa utmaningar, men ingen har gett en detaljerad och konsekvent protokoll för att övervinna dem 14,15. Detta manuskript kommer att införa en steg-för-steg metod beskriver tekniken för att utföra trypsin smälta på mus och råtta näthinnor med specifika tips om hantering av särskilt svåra steg. En schematisk översikt visas i figur 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Trypsin Digest är guldmyntfoten metod för att analysera näthinnan kärlsystemet 1-5. Det möjliggör visualisering av hela nätverk av komplexa tredimensionella retinala blodkärl och kapillärer genom att skapa en tvådimensionell platt-mount av sammanlänkade vaskulära kanalerna efter rötning av icke-vaskulära komponenter i näthinnan. Detta gör att man kan studera olika patologiska kärlförändringar, såsom microaneurysms, kapillär degeneration och onormal endotelceller att pericyter förhållanden. Emellertid är metoden tekniskt utmanande, särskilt i möss, som har blivit den mest tillgängliga djurmodell för att studera näthinnan på grund av den enkla genetiska manipulationer 6,7. I musen ögat, är det särskilt svårt att helt ta bort de icke-vaskulära komponenter samtidigt som det övergripande arkitekturen av näthinnans blodkärl. Hittills finns det en brist på litteratur som beskriver trypsin smälta tekniken i detalj in musen. Detta manuskript ger en detaljerad steg-för-steg metod för trypsin smälta i mus näthinnan, och samtidigt ge tips om felsökning svåra steg.

Den slutliga produkten av en lyckad procedur är en platt-mount av hela nätverket av musen retinal kärlsystemet, med arkitekturen bibehålls, färgades med antingen PAS / hematoxylin eller H &amp; E, som visas i figurerna 2-4. Klar differentiering av endotelceller och pericyter kan ses som visas i figur 3. I näthinnan, kärnorna av endotelceller är ovala eller avlånga och helhet ligga inom kärlväggen. Pericyter kärnor är små, sfäriska, bets tätt och i allmänhet har en utskj...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest är en av de vanligaste metoderna för att analysera retinal kärlsystem. Detta manuskript beskriver metoden i detalj, inklusive viktiga förändringar för att optimera tekniken och ta bort icke-vaskulär vävnad samtidigt som den övergripande arkitekturen av fartygen.

Trypsin Digest protokollet för att analysera den Retinal kärlsystemet av en musmodell

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

En Optic Nerve krosskada Murine modell för att studera näthinnan Survival Ganglion Cell

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriska Analyser av näthinnans avsnitt

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

En visuell beskrivning av dissektion av cerebral Surface kärlsystemet och associerade hjärnhinnor och koroidea Plexus från råtthjärna

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Implementera Dynamic Clamp med Synaptic och artificiella konduktanser i Mus Retinal ganglion celler

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Hornhinnans Micropocket Analys: En modell av angiogenes i mus Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Telomerasaktivitet i de olika regionerna i Mouse Brain: Ej Radioaktiv Telomeras Upprepa Amplification Protocol (TRAP) analys

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging Kartor Spatiotemporal Analysera gastrointestinal motilitet hos möss

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Protokoll för isolering musen Circle of Willis

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...