Name: trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model
Uploaded: 2013-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Bu çalışma kısmen NIH RO1-EY019951 (AAF), Körlük önlenmesi için Illinois Derneği (KİK, AAF), Körlük (RPB) Önleme Research Göz Hastalıkları Anabilim sınırsız para, NY ve RPB Tıp Öğrenci Bursu Grant tarafından desteklenmiştir (KİK).

1. Retina Hazırlık <ol><li> Fareyi göz tanıttılar. Tek elle, gözle görülebilecek şekilde göz kapakları açın. Diğer elinizle, kavisli bir forseps (kavisli yukarı bakacak şekilde) kullanarak, yörüngesinin üst ve alt yönleri üzerinde baskı uygulamak dünya çıkıntı kadar. Yavaşça gözün arka yönü de forseps kapatın ve göz tanıttılar sürekli bir hareket kaldırın. </li><li> Nötr% 10, en az 24 saat boyunca tamponlu formalin içine göz düzeltildi. </li><li> Küçük bir Petri kabındak...

<ol>
	<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture.">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).</li><li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+vascular+patterns.+VII.+Acellular+change.">Retinal vascular patterns. VII. Acellular change.</a> Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).</li><li>Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopathologic+and+trypsin+digestion+studies+of+the+retina+in+incontinentia+pigmenti.">Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti.</a> Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).</li><li>Danis, R. P., Wallow, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRP/trypsin+technique+for+studies+of+the+retinal+vasculature.">HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).</li><li>Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+studies+of+the+retina+in+a+new+diabetic+model;+SHR/N:Mcc-cp+rat.">Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat.</a> Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).</li><li>Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+mouse+retina.+Endothelial+cell-pericyte+ratio+and+capillary+distribution.">Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).</li><li>Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+procedures+for+isolating+intact+retinal+vascular+beds+from+diabetic+humans+and+animal+models.">Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).</li><li>Midena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+retina+of+the+diabetic+db/db+mouse.+I.+Endothelial+cell-pericyte+ratio.">Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio.</a> Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+30.">Chapter 30.</a> Diabetic Retinopathy. , (2005).</li><li>Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+6.19+Diabetic+Retinopathy.">Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy.</a> Ophthalmology. , (2008).</li><li>Friedenwald, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+some+problems+of+retinal+vascular+disease.">A new approach to some problems of retinal vascular disease.</a> Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).</li><li>Podesta, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bax+is+increased+in+the+retina+of+diabetic+subjects+and+is+associated+with+pericyte+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro.">Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro.</a> Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).</li><li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy.">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li><li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinovascular+physiology+and+pathophysiology:+new+experimental+approach/new+insights.">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).</li><li>Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+long-term+siRNA+strategy+regulates+fibronectin+overexpression+and+improves+vascular+lesions+in+retinas+of+diabetic+rats.">A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats.</a> Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+eNOS-knockout+mice+develop+accelerated+retinopathy.">Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).</li><li>Connor, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse:+a+model+of+vessel+loss,+vessel+regrowth+and+pathological+angiogenesis.">Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis.</a> Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).</li></ol>

Tripsin özet retinanın damar değerlendirmek için standart bir yöntemdir. Ne yazık ki, teknik olarak zor ve Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi durumunda numune kaybı yüksek oranda neden olabilir. Ayrıca, işlem göz hastalıkları, yaygın olarak kullanılan bir genetik hayvan modellerinde bu tekniğin uygulanması sınırlandıran, farelerde özellikle zordur. Bu kağıt fare gözünde etkin ve sürekli yordamı gerçekleştirmek için nasıl rehberlik sağlar. Protokolde pek ç...

Retinanın damar görselleştirme, diyabetik retinopati gibi çeşitli göz hastalıklarının mekanizmaları incelemek için son derece önemli bir yaklaşımdır. Bu bir mikroanevrizmalar, kılcal dejenerasyon ve pericyte kaybı 8,9 dahil olmak üzere en erken vasküler anormallikler, değerlendirmenizi sağlar. Bugüne kadar, retina damar analiz etmek için geliştirilen çeşitli teknikler olmuştur. Çeşitli boyaların Perfüzyon damarları vurgulamak için kullanılmıştır, ama benzer kısıtlamaları paylaştı. Gemiler 1 kırılması ve zarar riskleri bir yüksek basınç, verilen sürece Enjeksiyon nadiren tüm retina damar vurgulamaktadır. Fluorofor etiketli G B4 isolectin (, I21413, Invitrogen, konjuge Alexa Fluor 594 1:100 seyreltme) ile vasküler endotel immün ve retina düz bağlar gemilerin genel mimarisi vurgulamak, ama kılcal damarların detaylı görüntülenmesi, bazal membran ve perisitler olmadan olabilir . Bu tarafından not edildiGemilerin periyodik asit-Schiff (PAS) veya hematoksilen ve eozin (H &amp; E) boyama 10 ile retinanın düz bağlar boyama vurgulanan olabilir Friedenwald. Ancak, boyama gemilere spesifik olmayan ve de olmayan vasküler doku vurgulanır, zor damarları ayırt etmek için yapmak. 1960&#39;larda, Cogan ve Kuwabara daha kolay retina 1 nonvasküler bileşenleri sindirerek retina damar görselleştirmek için yapılan tripsin sindirmek tekniği geliştirdi. O zamandan beri, tripsin sindirmek retinanın 2-5 damar analiz altın standart yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, damar izole etmek için başka bir alternatif teknikler tarif edilmiştir dikkat etmek önemlidir. Ozmotik lizis kullanımı damar izole ve doku 11,12 biyokimyasal çalışmaları sağlamak için kullanılmıştır, ancak prosedür anatomik çalışma için birincil yöntem olarak kullanılmamıştır. Doku baskı yöntemi olmuşturmikrovasküler büyük bölümü izole etmek için kullanılan ve damar 13 elektrotonik mimarisi çalışma yeteneği sağlar. Teorik olarak, bu tekniği de gemilerin kalitesi yüksek olarak, anatomik değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Ancak, sadece damar ağı tüm bölümleri tespit edebilmektedir. Bu yöntemler tripsin sindirmek yerini alamaz rağmen, farklı avantajları ve eksiklikleri var ve bu konuda tamamlayıcı olduğunu not etmek önemlidir. Tripsin sindirmek yöntemi teknik olarak zor ve sürekli 6,7 gerçekleştirmek zordur. Ayrıca, bu istediği retina 6,7 genel vasküler mimarisi korumak için özellikle tripsin sindirmek, bir fare modeli özellikle zor olduğu görülmüştür. Sorunlar gerektiren, (1) yanı sıra, damar vasküler olmayan dokusu hem kaybına neden olan retinanın aşırı sindirilmesi, (2) altında yer sindirimen damar yatağının hasar, non-spesifik boyama yol açan damar gelen olmayan vasküler doku (3) kötü ayırma yol dönüşebilir geniş mekanik diseksiyonu. Çeşitli el yazmaları bu zorlukları ortaya koydu, ama hiçbiri onları 14,15 üstesinden gelmek için detaylı ve tutarlı bir protokol hazırladık. Bu yazının özellikle zor adımları kullanımı ile ilgili özel ipuçları ile fare ve sıçan retina üzerinde tripsin sindirmek gerçekleştirmek için teknik ayrıntılı bir adım adım yöntem tanıtacak. Şematik bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>SF100-4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (1:250)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0458-50G</td>
			<td>Make 3% trypsin in 0.1 M Tris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td>Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 &deg;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIZMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop sterile vacuum bottle</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Create filtered water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Forceps (Inox)</td>
			<td>Dumont #5</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forcepts (Dumostar)</td>
			<td>Dumont #7</td>
			<td>11297-10</td>
			<td>Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubnoff Metabolic Shaker Incubator</td>
			<td>Precision Scientific</td>
			<td>BDG59442</td>
			<td>Shaker optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353047</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-132</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model

Tripsin sindirmek retina damar 1-5 analiz etmek için altın standart bir yöntemdir. Bu retinanın vasküler olmayan bileşenlerin sindirim sonra birbirine vasküler kanalların bir iki boyutlu düz montaj oluşturarak karmaşık üç boyutlu retina kan damarları ve kılcal damarların tüm ağ görselleştirme sağlar. Bu böyle bir mikroanevrizmalar gibi çeşitli patolojik vasküler değişiklikler, kılcal dejenerasyon ve pericyte oranları anormal endotel çalışma sağlar. Ancak, yöntem hangi çünkü genetik manipülasyonlar 6,7 kolaylığı retina incelemek için en yaygın kullanılan hayvan modeli haline gelmiştir, özellikle farelerde, teknik olarak zordur. Fare gözünde, bu retinal kan damarlarının genel yapısını muhafaza ederken tamamen vasküler olmayan bileşenleri ortadan kaldırmak için özellikle zordur. Bugüne kadar, ayrıntılı olarak tripsin sindirmek teknik anlatılmaktadır edebiyat bir eksiklik olduğunu iFare n. Ayrıca zor adımlar sorun giderme ipuçları sağlarken Bu makale, fare retinada tripsin özet ayrıntılı bir adım adım yöntem sağlar.

Başarılı bir prosedür nihai ürün Şekil 2-4 de gösterildiği gibi mimari, PAS / hematoksilin ve H &amp; E ile boyandı ya da, muhafaza ile birlikte, fare retina damar sistemine ait bütün ağ düz bir montaj olup. Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi, endotelyal hücreler ve perisitler açık bir farklılaşma görülebilir. Retina endotelyal hücrelerinin çekirdeklerindeki oval veya uzun ve damar duvarı tamamen içinde yer alır. Pericyte çekirdekleri küçük, küresel, yoğ...

Watch this Scientific Journal Video about Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model at JoVE.com

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Tripsin sindirmek retina damar analiz etmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. Bu yazının gemilerin genel mimarisi korurken teknik optimize etmek ve olmayan vasküler doku kaldırmak için önemli değişiklikler de dahil olmak üzere, ayrıntılı olarak yöntem açıklanır.

Tripsin Digest Protokolü Fare Modeli Retina damarları Analiz

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Retina Ganglion Hücre Survival Eğitim Bir Optik Sinir Crush Yaralanma murin Modeli

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain

Rat Beyin gelen Serebral Yüzey damarları ve İlişkili Beyin zarları ve Diseksiyon ve Koroid Pleksus bir Görsel Açıklama

This video presentation was created to show a method of harvesting the two most important highly vascular structures, not residing within the brain ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Fare Retina Ganglion Hücreleri Synaptic ve Yapay iletkenlikleri Dinamik Kelepçe Uygulama

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

Kornea mikrocep Testi: Fare Eye Angiogenezis Bir Model

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol TRAP Assay

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Görüntüleme ve Spatiotemporal Haritalar Fare Gastrointestinal Motilite Analiz

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Willis Fare Çemberi Ayırma Protokolü

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...