Name: a sensitive method to quantify senescent cancer cells
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Vi takker SF 4206 Icore (Université de Caen) for anvendelsen af ​​cytometri facilitet. JC modtog ph.d.-stipendier fra Conseil de Radioprotection d&#39;EDF og Conseil Régional i Basse-Normandie. Disse data var en del af projekter finansieret af Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l&#39;Orne et du Calvados.

1.. Udarbejdelse af C12FDG, bafilomycin A1 og Cell Culture <ol><li> Opløs C 12 FDG pulver i dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 20 mM. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. DMSO bør anvendes med passende sikkerhedsbetingelser. </li><li> Opløs bafilomycin A1 pulver i DMSO til en slutkoncentration på 0,1 mM. Alikvot og opbevares ved - 20 ° C. Bafilomycin bør anvendes med passende sikkerhedsbetingelser. </li><li> Dyrke RPMI 8226 cellelinie eller andre cellelinier adhærente eller ikke, i me...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

Vi præsenteres her en flowcytometri-baserede metode til at kvantificere cellulær degeneration i levende kræftceller. Denne metode er baseret på anvendelsen af membranen permeabel substans, C 12 FDG, og kan derfor anvendes i alle celletyper og efter forskellige behandlinger, så længe forbindelsen er taget op af cellerne. Efter cellulær optagelse, er C 12 FDG hydrolyseres af β-galactosidase, beriget i lysosomer af senescentceller. Efter laserexcitation, udsender forbindelsen grøn fluorescens...

Siden begyndelsen af tresserne, og dens opdagelse af Hayflick og Moorhead, stadig senescence stadig et cellulært nysgerrighed 1.. Menneskelige celler ikke uendelige formere, og ved degeneration, opfandt Hayflick og Moorhead den cellulære ældningsprocessen. Ældning er en stabil cellecyklusstop hvor cellerne forbliver metabolisk aktive i modsætning til celledød. Til dato har fire cellulære mekanismer vist sig at inducere degeneration: telomer afkortning, DNA-skader, kromatin forstyrrelse, og unormal ekspression af mitogene onkogener 2. Dette indikerer, at ikke alene normale celler, men også kræftceller er i stand til at undergå senescens 3.. Som en kendsgerning, blev kræftceller undergår degeneration vist at udgøre en hindring for yderligere tumorudvikling 4-5. Imidlertid har flere rapporter nu påpeget, at under visse omstændigheder kan cellulære ældning også fremme malignitet 6-7. Studere ældning for kræft cells er ved at blive en trang i kræftforskning, som i øjeblikket anvendes kemoterapeutiske stoffer kan føre til degeneration af kræftceller ikke kun in vitro, men også in vivo 8.. Føreren assay til at undersøge for tilstedeværelsen af ​​senescentceller er β-galactosidaseanalyse i surt miljø. Denne histokemisk assay afspejler øget i lysosomale biogenese forekommer i de fleste senescentceller. Kort fortalt exogent X-gal, anvendt på celler, spaltes ved β-galactosidase beriget i lysosomer af senescentceller, giver anledning til en blå farve 9.. De blå senescentceller kan derefter kvantificeres under et lysfelt mikroskop. Selvom meget populær, præsenterer β-galactosidaseanalyse store ulemper. Først er dette assay udføres på fikserede celler. For det andet, det er tidskrævende, fordi det indebærer at kvantificere graden af ​​ældning ved at tælle et signifikant højt antal senescentceller under et mikroskop. Tredje dette assayer ikke følsom som den forskelsbehandling mellem ældede og ikke-senescentceller helt afhængig af observatør. Vi diskuterer her et uudnyttet, hurtig og følsom cytometri-baseret assay til at vurdere tilstedeværelsen af ​​levende senescentceller. Dette assay er baseret på hydrolyse af en membranpermeabel molekyle, 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG), ved β-galactosidase beriget i senescentceller. Efter hydrolyse og laser excitation udsender C 12 FDG grøn fluorescens, og kan derfor detekteres ved flowcytometri 10, 11. Påvisning af senescentceller via flowcytometri giver den store fordel at være hurtigere og mere følsom. Desuden kan detektering af senescentceller ved flowcytometri kobles med påvisning af andre cellulære markører. Dette assay kan anvendes til at detektere senescentceller i en population af kræftceller behandlet med kemoterapi og kan rutinemæssigt indstillesop på vævssnit, efter cellulær dissociation. i klinikken

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

Humane celler ikke uendelige formere sig. Ved eksterne og / eller indre cues, kan cellerne dø eller indtaste en stabil cellecyklusstop kaldes ældning. Adskillige cellulære mekanismer, såsom telomer afkortning og unormal udtryk for mitogene onkogener, har vist sig at forårsage degeneration. Ældning er ikke begrænset til normale celler, cancerceller er også blevet rapporteret at senesce. Chemotherapeutical lægemidler har vist sig at inducere degeneration i kræftceller. Men det er stadig kontroversielt, om degeneration forhindrer eller fremmer tumorigenese. Da det i sidste ende kunne være patient-specifikke, vil en hurtig og følsom metode til at vurdere senescens i kræftcellen snart være påkrævet. Til dette formål viser standard β-galactosidaseanalyse, den anvendte metode, alvorlige ulemper: det er tidskrævende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baseret assay at studere ældning på live celler. Dette assay har den fordel af at være hurtig, følsom, og kan kobles til immunolabeling af forskellige cellulære markører.

Myelomatose, en hæmatologisk malignitet, blev anvendt til at evaluere degeneration induceret af en kemoterapeutiske procedure. At gøre en kommercielt tilgængelig MM cellelinje (RPMI 8226) blev behandlet i 2 dage med doxorubicin, et kemoterapeutiske lægemiddel. Cellerne blev derefter underkastet bafilomycin A1 behandling og yderligere inkuberet med C 12 FDG. Celler blev analyseret ved flowcytometri. Figur 1 illustrerer de forskellige trin og viser, at procentdelen af senescentceller kan be...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Hvorvidt senescence forhindrer eller fremmer tumorigenese stadig kontroversielt. Da chemotherapeutical medicin kan fremkalde kræftceller til senesce, studere senescence er afgørende for at foreslå nye behandlingsformer. Men den standard og bredt anvendt β-galactosidaseanalyse giver store ulemper. Vi foreslår her en hurtig og følsom flowcytometri-baseret assay at kvantificere degeneration.

En følsom metode til at kvantificere ældede kræftceller

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

A Real-time elektriske impedans Baseret Teknik til måling Invasionen af ​​Endotel cellemonolag ved kræftceller

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensionelle Cultures: Et værktøj til at studere Normal Acinar Architecture vs malign transformation af brystkræft celler

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Fremgangsmåde til at opnå primær ovariecancer celler fra Solid Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

En<em&gt; In vitro</em&gt; Vækstdvale Model af østrogen-følsomme brystkræft i knoglemarven: Et værktøj for molekylære mekanisme Studier og Hypotese Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Udnyttelse af blød agar Colony Formation Assay til at identificere inhibitorer for tumorgenicitet for Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...