Name: a sensitive method to quantify senescent cancer cells
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Wij danken de SF 4206 Icore (Universite de Caen) voor het gebruik van de cytometrie faciliteit. JC ontvangen post-doctorale beurzen van Conseil de radioprotectie d&#39;EDF en de Conseil Regional van Basse-Normandie. Die gegevens waren onderdeel van gefinancierd door de Ligue Nationale contre le Cancer projecten - Comites de l&#39;Orne et du Calvados.

1. Voorbereiding van C12FDG, bafilomycine A1 en Cultuur van de Cel <ol><li> Los de C 12 FDG poeder in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 20 mM. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. DMSO moet worden gebruikt met de juiste veiligheidsvoorschriften. </li><li> Los het poeder bafilomycine A1 in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM. Aliquot en bewaar bij - 20 ° C. Bafilomycine moet worden gebruikt met de juiste veiligheidsvoorschriften. </li><li> Cultiveren RPMI 8226 cellijn...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

We presenteerde hier een flowcytometrie-gebaseerde methode om cellulaire veroudering in levende kankercellen te kwantificeren. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van het membraan permeabele stof, de C 12 FDG, en kan daarom worden gebruikt in een cel types en na verschillende behandelingen zolang de verbinding wordt opgenomen door de cellen. Bij cellulaire opname, de C 12 FDG gehydrolyseerd door β-galactosidase, verrijkt in lysosomen van verouderde cellen. Na laser excitatie, de verbinding ze...

Sinds begin jaren zestig en de ontdekking door Hayflick en Moorhead, veroudering blijft een cellulair nieuwsgierigheid 1. Menselijke cellen niet onbeperkt groeien en, door veroudering, Hayflick en Moorhead bedacht de cellulaire proces van veroudering. Senescentie is een stabiel celcyclus waarbij cellen metabool actief blijven in tegenstelling tot celdood. Tot op heden hebben vier cellulaire mechanismen aangetoond dat veroudering veroorzaken: telomeerverkorting, DNA-schade, chromatine verstoring, en abnormale expressie van mitogene oncogenen 2. Dit geeft aan dat niet alleen normale cellen maar ook kankercellen kunnen ondergaan senescentie 3. Als een zaak van de feiten, werden kankercellen ondergaan veroudering aangetoond dat een barrière voor verdere progressie van de tumor 4-5 vormen. Toch hebben verschillende rapporten nu op gewezen dat, onder bepaalde omstandigheden, kan cellulaire veroudering ook bevorderen maligniteit 6-7. Studeren veroudering van kanker cells is ongeveer om een drang in kankeronderzoek zoals momenteel gebruikte chemotherapeutische geneesmiddelen kan leiden tot veroudering van kankercellen niet alleen in vitro, maar ook in vivo 8 geworden. De master assay te onderzoeken op de aanwezigheid van verouderde cellen is β-galactosidase assay bij zure pH. Dit histochemische test weerspiegelt de toegenomen lysosomale biogenese zich in de meeste verouderde cellen. Kort exogene X-gal, toegepast op cellen, wordt gesplitst door β-galactosidase verrijkt in lysosomen van verouderde cellen, waardoor een blauwe kleur 9. De blauwe verouderde cellen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd onder een helder veld microscoop. Hoewel zeer populair, de β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. Eerst wordt deze test uitgevoerd op gefixeerde cellen. Ten tweede is tijdrovend omdat het impliceert de mate van senescentie kwantificeren door telling significant groot aantal verouderde cellen onder een microscoop. Ten derde, het assayis niet gevoelig als de discriminatie tussen verouderde en niet-verouderde cellen vertrouwt volledig op de waarnemer. We bespreken hier een onontgonnen, snelle en gevoelige cytometrie-gebaseerde test om te beoordelen op de aanwezigheid van levende verouderde cellen. Deze test is gebaseerd op de hydrolyse van een doorlatend membraan molecuul, de 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (FDG C 12), door β-galactosidase verrijkt in verouderde cellen. Na hydrolyse en laser excitatie, de C 12 FDG zendt groene fluorescentie en derhalve worden gedetecteerd door flow cytometrie 10, 11. De detectie van verouderde cellen via flowcytometrie biedt het grote voordeel dat snelle en gevoelige. Bovendien kan detectie van verouderde cellen door flowcytometrie worden gekoppeld aan de detectie van andere cellulaire markers. Deze test kan worden gebruikt om verouderde cellen te detecteren in een populatie van kankercellen behandeld met chemotherapie en kan routinematig wordenup op weefselcoupes, na cellulaire dissociatie, in de kliniek.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

Menselijke cellen niet onbeperkt vermenigvuldigen. Bij externe en / of extrinsieke factoren, kan cellen sterven of voer een stabiele celcyclus genoemd senescentie. Verschillende cellulaire mechanismen, zoals telomere verkorting en abnormale expressie van oncogenen mitogene, is aangetoond dat veroudering veroorzaken. Senescentie is niet beperkt tot normale cellen, kankercellen ook gerapporteerd senesce. Chemotherapeutische geneesmiddelen is aangetoond senescentie induceren in kankercellen. Het blijft echter controversieel of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren. Omdat het uiteindelijk misschien patiëntspecifieke, zal een snelle en gevoelige methode voor senescentie in kankercel beoordelen binnenkort nodig. Daartoe de standaard β-galactosidase assay, de gebruikelijke methode nog voor grote nadelen: het is tijdrovend en ongevoelig. We stellen hier een doorstroomcytometrie-gebaseerde test senescentie op li bestuderenve cellen. Deze test heeft het voordeel dat snelle, gevoelige, en kan worden gekoppeld met de immunokleuring van verschillende cellulaire markers.

Multiple Myeloma, een hematologische maligniteit, werd gebruikt om de senescentie geïnduceerd door chemotherapeutische methoden te beoordelen. Daartoe is een commercieel beschikbare MM cellijn (RPMI 8226) werd behandeld voor 2 dagen met doxorubicine, een chemotherapeutische geneesmiddelen. De cellen werden vervolgens onderworpen aan bafilomycine A1 behandeling en verder geïncubeerd met C 12 FDG. Cellen werden geanalyseerd door flow cytometrie. Figuur 1 toont de verschillende stappen en laat...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Corneale confocale microscopie: een nieuwe niet-invasieve techniek voor de Small Fibre Pathologie kwantificeren Perifere Neuropathieën

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Drie dimensionaal culturen: Een hulpmiddel om te studeren Normaal Acinaire Architectuur versus maligne transformatie van cellen borst

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Methode voor het verkrijgen van Primary eierstokkankercellen Van Solid Exemplaren

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Kiemrust Model van oestrogeen-gevoelige Borstkanker in het beenmerg: A Tool for Molecular Mechanism Studies en Hypothese Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Gebruik van de zachte agar Colony Formation Assay aan Remmers van tumorigeniciteit in borstkankercellen Identificeer

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...