Name: a sensitive method to quantify senescent cancer cells
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00
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Wir danken dem SF 4206 ICORE (Université de Caen) für die Nutzung der Durchflusszytometrie Anlage. JC erhielt Post-Doc-Stipendien aus Conseil de Strahlenschutz d&#39;EDF und Conseil Régional der Basse-Normandie. Diese Daten wurden im Rahmen von Projekten von der Ligue Nationale contre le Cancer finanziert - Comités de l&#39;Orne et du Calvados.

1. Herstellung von C12FDG, Bafilomycin A1 und Zellkultur <ol><li> Man löst den C 12 FDG Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer Endkonzentration von 20 mM. Aliquot und bei -20 ° C DMSO sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden. </li><li> Man löst den bafilomycin A1 Pulver in DMSO auf eine Endkonzentration von 0,1 mM. Aliquot und lagern bei - 20 ° C. Bafilomycin sollte mit entsprechenden Sicherheits-Bedingungen verwendet werden. </li><li> Kultivieren RPMI 8226-Zellinie, oder a...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

Wir präsentierten hier eine Durchflusszytometrie basierende Methode, um zelluläre Seneszenz in lebenden Krebszellen zu quantifizieren. Diese Methode beruht auf der Verwendung der Membran durchlässig Verbindung, die C 12-FDG Basis und kann daher in allen Zelltypen und nach verschiedenen Behandlungen verwendet werden, solange die Verbindung von den Zellen aufgenommen. Nach Aufnahme in die Zelle ist die C 12 FDG hydrolysiert durch die β-Galactosidase, in Lysosomen von alternden Zellen angereichert...

Seit Anfang der sechziger Jahre und seiner Entdeckung durch Hayflick und Moorhead, Seneszenz bleibt eine zelluläre Neugier 1. Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren und durch Seneszenz Hayflick und Moorhead den zellulären Alterungsprozess geprägt. Seneszenz ist eine stabile Arretierung des Zellzyklus in dem Zellen metabolisch aktiv bleiben, um Zelltod entgegen. Bisher wurden vier zellulären Mechanismen gezeigt, Seneszenz induzieren: Verkürzung der Telomere, DNA-Schäden, Chromatin Störung und abnormale Expression von Onkogenen mitogene 2. Dies deutet darauf hin, dass nicht nur normale Zellen, sondern auch Krebszellen sind in der Lage, Seneszenz 3 zu unterziehen. In der Tat wurden Krebszellen unterziehen Seneszenz gezeigt, um eine Barriere zur weiteren Tumorprogression 4-5 darstellen. Allerdings haben einige Berichte nun darauf hin, dass unter bestimmten Umständen, zelluläre Seneszenz kann auch die Förderung Bösartigkeit 6-7 hingewiesen. Studieren Seneszenz von Krebs cells ist im Begriff, ein Drang in der Krebsforschung als derzeit verwendeten Chemotherapeutika können Seneszenz von Krebszellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo 8 führen werden. Die Master-Assay, um das Vorhandensein von alternden Zellen zu untersuchen ist β-Galactosidase-Assay bei saurem pH-Wert. Diese histochemischen Test spiegelt die in lysosomalen Biogenese vorkommenden in den meisten alternden Zellen erhöht. Kurz gesagt, wird exogene X-gal, die auf Zellen von β-Galactosidase in Lysosomen von alternden Zellen angereichert gespalten, was zu einer blauen Farbe 9. Die blauen alternden Zellen können dann unter einem Hellfeld-Mikroskop quantifiziert werden. Obwohl sehr beliebt, stellt die β-Galactosidase Assay große Nachteile. Zuerst wird dieser Test auf fixierte Zellen durchgeführt. Zweitens ist es sehr zeitaufwendig, weil es um den Grad der Seneszenz durch Zählen eine signifikant hohe Anzahl von alternden Zellen unter einem Mikroskop zu quantifizieren impliziert. Drittens, dieser Testnicht empfindlich ist als die Unterscheidung zwischen alternden und nicht-alternden Zellen ganz auf die Betrachter. Wir diskutieren hier ein ungenutztes, schnell und empfindlich Durchflusszytometrie basierende Assay auf das Vorhandensein von lebenden alternden Zellen beurteilen. Dieser Assay auf der Hydrolyse von einer Membran durchlässig Molekül, das 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG) basiert, durch β-Galactosidase in alternden Zellen angereichert. Nach der Hydrolyse-und Laser-Anregung emittiert der C 12 FDG grüne Fluoreszenz und kann daher mittels Durchflusszytometrie 10, 11 detektiert werden. Der Nachweis von alternden Zellen via Durchflusszytometrie bietet den großen Vorteil, dass sie schneller und empfindlicher. Darüber hinaus kann die Erfassung von alternden Zellen mittels Durchflusszytometrie mit der Detektion von anderen zellulären Marker gekoppelt werden. Dieser Test kann verwendet werden, um alternde Zellen in einer Population von Krebszellen mit einer Chemotherapie behandelt werden, erkennen und kann routinemäßig eingestellt werdenauf Gewebeschnitten nach zellulären Dissoziation, in der Klinik.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

Menschliche Zellen nicht unbegrenzt vermehren. Bei externen und / oder intrinsische Signale könnten Zellen sterben oder geben Sie einen stabilen Zellzyklus genannt Seneszenz. Mehrere zellulären Mechanismen, wie Telomerverkürzung und abnormale Expression mitogene Onkogene, haben gezeigt, dass Seneszenz bewirken. Seneszenz nicht auf normalen Zellen beschränkt; Krebszellen haben auch berichtet, altern. Chemotherapeutika wurde gezeigt, Seneszenz in Krebszellen zu induzieren. Es bleibt jedoch umstritten, ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung. Als es schließlich könnte Patienten-spezifischen, wird eine schnelle und empfindliche Methode zur Seneszenz in Krebszelle beurteilen bald erforderlich sein. Zu diesem Zweck stellt die Standard-β-Galactosidase-Assay wird die aktuell verwendete Methode, wesentliche Nachteile: es ist zeitaufwendig und nicht empfindlich. Wir schlagen hier eine Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Seneszenz auf li studierenve Zellen. Dieser Test hat den Vorteil, dass eine schnelle, empfindliche und können zur Immunmarkierung von verschiedenen zellulären Marker gekoppelt werden.

Multiples Myelom, eine hämatologische Malignität, wurde verwendet, um das Altern von einem chemotherapeutischen Verfahren induziert bewerten. Dazu muss ein handelsübliches MM-Zelllinie (RPMI 8226) für 2 Tage mit Doxorubicin, einem chemotherapeutischen Medikament behandelt wurde. Die Zellen wurden dann bafilomycin A1 unterzogen und weiter mit C 12 FDG inkubiert. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Abbildung 1 zeigt die verschiedenen Schritte und zeigt, dass der Proze...

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A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Forschung

Medizin

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

Corneal konfokale Mikroskopie: A Novel Non-invasive Technik zu Small Fibre Pathologie in peripheren Neuropathien Quantify

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Eine Echtzeit-Elektrische Impedanz basierte Technik zur Invasion von Endothelzellen Monolayer von Krebs Zellen zu messen

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Eine einfache Anleitung Screw Verfahren zur Intrakranielle Xenograft Studien an Mäusen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Dreidimensional Kulturen: Ein Werkzeug, um Architektur zu studieren Normale acinar gegen maligne Transformation von Brustzellen

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

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Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

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An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

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Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...