Name: a sensitive method to quantify senescent cancer cells
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

אנו מודים SF 4206 ICORE (אוניברסיטת דה קאן) עבור השימוש במתקן cytometry. JC קיבל מלגות לפוסט דוקטורט מConseil d&#39;דה Radioprotection EDF וConseil האזורי של נורמנדי התחתי. נתונים אלה היו חלק מפרויקטים שמומנו על ידי Ligue Nationale contre le הסרטן - Comités de l&#39;אורן et du קלבדוס.

1. הכנת C12FDG, bafilomycin A1 ותא התרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את אבקת 12 C FDG בsulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 20 מ&quot;מ. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. DMSO יש להשתמש בתנאי בטיחות מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את אבקת bafilomycin A1 ב DMSO לריכוז סופי...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

הצגנו כאן שיטה המבוססת על זרימת cytometry לכמת הזדקנות תאית בתאי סרטן חיים. שיטה זו מבוססת על השימוש במתחם החדיר הקרום, FDG C 12, ולכן יכולה לשמש בכל סוגי תאים, ולאחר טיפולים שונים, כל עוד המתחם הוא נלקח על ידי התאים. על ספיגת הסלולר, FDG C 12 הוא הידרוליזה על ידי β-גלקט?...

מאז ראשית שנות השישים וגילויו על ידי Hayflick ומורהד, הזדקנות עדיין נשארה סקרנות סלולרית 1. תאים אנושיים לא לזמן בלתי מוגבל ולהתרבות, על ידי הזדקנות, Hayflick ומורהד טבעו את התהליך הסלולרי של הזדקנות. הזדקנות היא עצירת מחזור תא יציב שבו תאים נשארים פעילים מטבולית בניגוד למוות תאי. נכון להיום, ארבעה מנגנונים תאיים הוכחו לגרום להזדקנות: התקצרות הטלומרים, נזק לדנ&quot;א, הפרעות הכרומטין, וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic 2. זה מצביע על כך לא רק תאים נורמלים, אלא גם תאים סרטניים מסוגלים לעבור הזדקנות 3. כעניין של עובדה, תאים סרטניים שעברו הזדקנות הוצגו מהווים מכשול להתקדמות נוספת 4-5 גידול. עם זאת, מספר דוחות החברה ציינו כי, בנסיבות מסוימות, הזדקנות תאית יכולה גם לקדם ממאירות 6-7. לומד הזדקנות של הסרטן celLS עומד להיות דחף בחקר הסרטן המשמש כיום כתרופות כימותרפיות יכולות להוביל להזדקנות של תאים סרטניים במבחנה לא רק, אלא גם in vivo 8. Assay האדון לחקור את הימצאותם של תאים מזדקנים הוא assay β-גלקטוזידאז ב-pH חומצי. assay histochemical זה משקף את העלייה בbiogenesis lysosomal מתרחש ברוב התאים מזדקנים. בקצרה, אקסוגני X-gal, הוחל לתאים, הוא ביקע ידי β-גלקטוזידאז המועשר בlysosomes של תאים מזדקנים, והוליד צבע כחול 9. לאחר מכן ניתן לכמת את התאים המזדקנים הכחולים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. אמנם פופולרי מאוד, assay β-גלקטוזידאז מציג חסרונות עיקריים. ראשית, assay זה מתבצע בתאים קבועים. שנית, זה זמן רב, משום שמשתמע לכמת את מידת ההזדקנות על ידי ספירת מספר גבוה באופן משמעותי של תאים מזדקנים תחת מיקרוסקופ. שלישית, assay זהאינו רגיש לאפליה בין תאים מזדקנים ואינם senescent לחלוטין מסתמכת על המתבונן. אנו דנים כאן assay בלתי מנוצל, מהיר, ורגיש המבוסס על cytometry להעריך את הימצאותם של תאים מזדקנים חיים. assay זה מבוסס על הידרוליזה של מולקולה חדירה קרום, 5 dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C 12 FDG), על ידי β-גלקטוזידאז מועשר בתאים מזדקנים. לאחר הידרוליזה ועירור לייזר, FDG C 12 פולט הקרינה ירוקה ולכן יכול להיות מזוהה על ידי זרימת cytometry 10, 11. זיהוי של תאים מזדקנים באמצעות cytometry הזרימה מציע את היתרון של להיות מהיר ורגיש מאוד. בנוסף לכך, זיהוי של תאים מזדקנים ידי cytometry הזרימה יכול להיות בשילוב עם זיהוי של סמנים תאיים אחרים. assay זה יכול לשמש כדי לזהות תאים מזדקנים בתוך אוכלוסייה של תאים סרטניים שטופלו בכימותרפיה וניתן להגדיר באופן שגרתיעל סעיפי רקמות, לאחר הניתוק סלולרי, במרפאה.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

תאים אנושיים לא ללא הגבלת זמן להתרבות. על הרמזים חיצוניים ו / או פנימיים, תאים עלולים למות או להיכנס לעצירת מחזור תא יציב הנקראת הזדקנות. כמה מנגנונים תאיים, כמו התקצרות הטלומרים וביטוי לא תקין של אונקוגנים mitogenic, הוכחו לגרום להזדקנות. הזדקנות אינה מוגבלת לתאים נורמלים; כבר דיווחו תאים סרטניים גם להזדקן. תרופות Chemotherapeutical הוכחו לגרום להזדקנות בתאים סרטניים. עם זאת, נותר שנוי במחלוקת בין ההזדקנות מונעת או מקדמת tumorigenesis. כפי שסופו של דבר עשוי להיות מטופל ספציפי, שיטה מהירה ורגישה להערכת הזדקנות בתא סרטני בקרוב תידרש. לשם כך, assay הסטנדרטי β-גלקטוזידאז, שיטה המשמשת כיום, מציגה חסרונות עיקריים: זה זמן רב ולא רגיש. אנו מציעים כאן assay מבוסס cytometry זרימה ללמוד הזדקנות על live תאים. assay זה מציע את היתרון של להיות מהיר, רגיש, ויכול להיות בשילוב לimmunolabeling של סמנים תאיים שונים.

מיאלומה נפוצה, גידול ממאיר המטולוגיות, שימש כדי להעריך את ההזדקנות נגרמת על ידי הליך chemotherapeutical. כדי לעשות זאת שורת תאי MM זמינה מסחרי (RPMI 8226) טופלה במשך 2 ימים עם דוקסורוביצין, תרופת chemotherapeutical. התאים אז היו נתונים לטיפול A1 bafilomycin וטופחו עוד יותר עם ​​C 12 FDG. תאים נות...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

אם מונעת הזדקנות או מקדמת tumorigenesis נותר שנוי במחלוקת. מאז תרופות chemotherapeutical יכולות לגרום לתאים סרטניים להזדקן, לומד הזדקנות הוא חיוני למציעים טיפולים חדשים. עם זאת, assay β-גלקטוזידאז הסטנדרטי ומשמש באופן נרחב מציג חסרונות עיקריים. אנו מציעים כאן assay מבוסס זרימת cytometry מהירה ורגיש לכמת הזדקנות.

שיטה רגישה לכמת תאי סרטן senescent

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

מיקרוסקופיה confocal קרנית: שיטה חדשנית לא פולשני לכמת סיב פתולוגיה קטנים neuropathies היקפיים

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

מדריך פשוט בורג שיטה ללימודי xenograft תוך גולגולתי של עכברים

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

<em&gt; במבחנה</em&gt; תרדמת דגם של סרטן השד רגיש לאסטרוגן במוח העצם: כלי ללימודי מנגנון מולקולרי והשערת דור

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

ניצול של assay כינונה רך אגר מושבה לזיהוי מעכבי tumorigenicity בתאי סרטן השד

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...