Name: a sensitive method to quantify senescent cancer cells
Uploaded: 2013-08-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Vi takker SF 4206 icore (Université de Caen) for bruk av cytometry anlegget. JC fikk postdocs fra Conseil de strålevern d&#39;EDF og Conseil Régional av Basse-Normandie. Disse data var en del av prosjekter finansiert av Ligue Nationale contre le Cancer - comites de l&#39;Orne et du Calvados.

En. Utarbeidelse av C12FDG, Bafilomycin A1, og cellekultur <ol><li> Oppløs C 12 FDG pulver i dimetylsulfoksyd (DMSO) til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Delmengde og oppbevar ved -20 ° C. DMSO bør brukes med passende sikkerhetsforhold. </li><li> Oppløs bafilomycin A1 pulver i DMSO til en endelig konsentrasjon på 0,1 mM. Delmengde og oppbevares ved - 20 ° C. Bafilomycin bør brukes med passende sikkerhetsforhold. </li><li> Dyrk RPMI 8226-cellelinjen, eller andre cellelinjer heftende eller ikke, i medi...

<ol>
	<li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains.">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li><li>Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence:+when+bad+things+happen+to+good+cells.">Cellular senescence: when bad things happen to good cells.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).</li><li>Shay, J. W., Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+senescence+in+carcinogenesis+and+cancer+therapy.">Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy.</a> Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).</li><li>Bartkova, J., Rezaei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+part+of+the+tumorigenesis+barrier+imposed+by+DNA+damage+checkpoints.">Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints.</a> Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).</li><li>Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+and+inflammatory+signaling+limit+the+MLL-ENL-induced+leukemogenesis+in+vivo.">DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo.</a> Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).</li><li>Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescent+fibroblasts+promote+epithelial+cell+growth+and+tumorigenesis:+a+link+between+cancer+and+aging.">Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).</li><li>Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor.">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).</li><li>Roninson, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+senescence+in+cancer+treatment.">Tumor cell senescence in cancer treatment.</a> Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).</li><li>Dimri, G. P., Lee, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo.">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).</li><li>Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+(beta)-galactosidase+reflects+an+increase+in+lysosomal+mass+during+replicative+ageing+of+human+endothelial+cells.">Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells.</a> Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).</li><li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+(SA-betagal)+activity,+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo.">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li><li>Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+secretory+phenotype+favors+the+emergence+of+cancer+stem-like+cells.">Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells.</a> Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).</li></ol>

Vi presenteres her en flowcytometri-basert metode for å kvantifisere mobilnettet senescence i levende kreftceller. Denne metoden er basert på bruk av membranen permeabel forbindelse, C 12 FDG, og kan derfor benyttes i alle celletyper og etter forskjellige behandlinger så lenge forbindelsen blir tatt opp av cellene. Ved cellulært opptak, er C 12 FDG hydrolysert ved β-galaktosidase, anriket på lysosomene til senescent celler. Etter laser eksitasjon, avgir det sammensatte grønn fluorescens, noe...

Siden begynnelsen av sekstitallet og sin oppdagelse av Hayflick og Moorhead, forblir senescence fortsatt en mobil nysgjerrighet en. Menneskeceller ikke ubestemt tid spre seg og, etter senescence, Hayflick og Moorhead innførte mobilnettet aldringsprosessen. Senescence er en stabil cellesyklus-stans i hvilken celler forblir metabolsk aktive i motsetning til cellulær død. Hittil har fire cellulære mekanismene vist seg å indusere senescence: telomerer forkortes, DNA-skade, kromatin uro og unormal uttrykk for mitogene oncogenes to. Dette indikerer at ikke bare normale celler, men også kreftceller er i stand til å gjennomgå senescens 3.. Som et spørsmål om Faktisk ble kreftceller gjennomgår senescens vist seg å utgjøre en barriere mot ytterligere tumor progresjon 4-5. Imidlertid har flere rapporter nå påpekt at, under visse omstendigheter, kan cellular senescence også fremme malignitet 6-7. Studerer senescence av kreft cells er i ferd med å bli en trang i kreftforskning som i dag brukes cellegifter kan føre til senescence av kreftceller ikke bare in vitro, men også in vivo åtte. Master analyse for å undersøke for tilstedeværelse av senescent celler er β-galaktosidase-analyse ved sur pH. Dette histochemical analysen reflekterer økt i lysosomalt biogenesis forekommer i de fleste senescent celler. Kort fortalt blir eksogene X-gal, anvendt på celler, spaltet ved β-galaktosidase anriket på lysosomene til senescent celler, gir opphav til en blå farge 9.. De blå senescent cellene kan da kvantifiseres under et sterkt felt mikroskop. Selv om svært populært, presenterer β-galaktosidase analysen store ulemper. Først blir denne analysen utført på faste celler. For det andre er det tidkrevende, fordi det innebærer å kvantifisere graden av senescence ved å telle en betydelig høyt antall senescent cellene under et mikroskop. Tredje, denne analysener ikke følsom som diskriminering mellom senescent og ikke-senescent celler helt avhengig av observatøren. Vi diskuterer her et uutnyttet, rask og følsom cytometry-baserte analysen å vurdere for tilstedeværelse av levende senescent celler. Denne analysen er basert på hydrolyse av en permeabel membran molekyl, 5-di-dodecanoylaminofluorescein β-D-galaktopyranosid (C 12 FDG), ved β-galaktosidase anriket på senescent celler. Etter hydrolyse og laser-eksitasjon, avgir C 12 FDG grønn fluorescens og kan derfor påvises ved flyt-cytometri 10, 11 sammen. Påvisning av senescent celler via flow cytometri byr den store fordel av å være hurtig og følsom. I tillegg kan påvisning av senescent celler ved flow cytometri være kombinert med påvisning av andre cellulære markører. Denne analysen kan brukes til å detektere senescent celler i en populasjon av kreftceller behandlet med kjemoterapi og kan rutinemessig sattopp på vevsdelene, etter mobilnettet dissosiasjon, i klinikken.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>5-dodecanoylaminofluorescein di-&beta;-D-galactopyranoside </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-2893</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Bafilomycin A1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B1793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Doxorubicin</td>
			<td>Sandoz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640 cell culture medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-702</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>PAA Laboratories GmBH</td>
			<td>A15 101</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5290-018</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Gallios flow cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A94291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

a sensitive method to quantify senescent cancer cells

Menneskeceller ikke ubestemt tid sprer. Ved eksterne og / eller indre signaler, kan celler dør eller angi en stabil cellesyklus arrest kalt senescence. Mange cellulære mekanismer, for eksempel telomerer forkortes og unormal ekspresjon av mitogene onkogener, har vist seg å forårsake begynnende alderdom. Senescence er ikke begrenset til normale celler, kreftceller har også blitt rapportert å senesce. Chemotherapeutical narkotika har vist seg å indusere senescence i kreftceller. Imidlertid er det fortsatt kontroversielt hvorvidt senescence hindrer eller fremmer tumorigenesis. Som det kan eventuelt være pasient-spesifikke, vil en hurtig og følsom metode for å vurdere senescens i kreftcelle snart være nødvendig. For dette formål, presenterer standard β-galaktosidase-analyse, den for tiden brukte metode, store ulemper: det er tidkrevende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baserte analysen for å studere senescence på live celler. Denne analysen har fordelen av å være hurtig, sensitiv og kan kobles sammen med den immunolabeling av ulike cellulære markører.

Multippelt myelom, en hematologisk malignitet, ble brukt til å evaluere senescens indusert av en chemotherapeutical prosedyre. For å gjøre dette en kommersielt tilgjengelig MM cellelinje (RPMI 8226) ble behandlet for to dager med doksorubicin, en chemotherapeutical stoffet. Cellene ble deretter underkastet bafilomycin A1 behandling og videre inkubert med C 12 FDG. Cellene ble analysert ved strømningscytometri. Figur 1 illustrerer de ulike trinnene og viser at prosentandelen av senescent c...

Watch this Scientific Journal Video about A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells at JoVE.com

A Sensitive Method to Quantify Senescent Cancer Cells

Enten senescence hindrer eller fremmer tumorigenesis fortsatt kontroversielt. Siden chemotherapeutical medikamenter kan indusere kreft celler til å senesce, studere senescence er avgjørende for å foreslå nye behandlingsformer. Imidlertid presenterer standard og bredt brukes β-galaktosidase-analyse store ulemper. Det foreslås her en hurtig og følsom flowcytometri-basert assay for å kvantifisere senescens.

En følsom metode for å kvantifisere senescent kreftceller

Human cells do not indefinitely proliferate. Upon external and/or intrinsic  cues, cells might die or enter a stable cell cycle arrest called senescence. ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Corneal Confocal Microscopy: A Novel Non-invasive Technique to Quantify Small Fibre Pathology in Peripheral Neuropathies

The accurate quantification of peripheral neuropathy is important to define at risk patients, anticipate deterioration, and assess new therapies. ...

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

A Real-time elektrisk impedans Basert teknikk for å måle Invasjonen av Endothelial cellemonoskiktet av kreftceller

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensjonal kulturer: Et verktøy for å studere Normal acinar Arkitektur vs malign transformasjon av brystkreft celler

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Metode for Innhenting av primær eggstokkreft celler fra solide Prøver

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Dormancy Modell av østrogen-sensitive brystkreft i benmargen: Et verktøy for molekylære mekanismen Studier og Hypotese Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Utnyttelse i Soft Agar Colony Forming analyse for å identifisere hemmere av tumorgenisitet i brystkreftceller

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...