Name: examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

نشكر جيليان ستانفيلد للتعليق على المخطوطة. ويدعم TAJ من جامعة يوتا علم الوراثة تدريب جرانت T32-GM007464 من NIGMS المعاهد الوطنية للصحة.

1. الجيل فسيفساء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصليب الوراثية ث FRT 19A الحوض: GAL80 FLP 122 / Y؛ زجاجة، GAL4، UAS GFP-(ذكور) X * FRT 19A / بال (الإناث)، حيث * يمثل متحولة لفحصها. ملاحظة: إعداد عبور يوم واحد على الأقل قبل التجر?...

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

تقنية تثبيت حرارة الموصوفة هنا هي أداة سريعة ومريحة للتصوير ذبابة الفاكهة اليرقات الخلايا محطة القصبة الهوائية. هنا، ونحن نستخدم هذه التقنية لدراسة المتفرعة ونمط التجويف من الخلايا من النوع البري. خلايا القصبة الهوائية معربا عن GFP، مدفوعا المروج محددة القصبة ا...

شكل الخلية هو أمر حاسم لوظيفة الخلايا الفردية داخل الكائن الحي، وكذلك الخلايا التي وظيفة كجزء من النسيج أو العضو. نحن نستخدم خلايا ذبابة الفاكهة محطة القصبة الهوائية، وهو مكون من الجهاز التنفسي الحشرات، للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تشارك في السيطرة على نوعين الحفظ من التشكل الخلوي: المتفرعة وتشكيل أنبوب (lumenogenesis). وتقع محطة الخلايا على نصائح من شبكة من أنابيب متفرعة الذي يعمل على إيصال الأوكسجين إلى الأنسجة الداخلية (1) ولها مورفولوجيا متفرعة معقدة والتي تعتمد على مسار الإشارات جمعية جيل المستقبل التي تسيطر عليها مستويات الاوكسجين المحلية داخل الأنسجة المستهدفة 2. فروع الخلية محطة هي أنابيب رقيقة، مع التجويف التحت خلوية مليئة بالغاز من خلال تشغيل كل فرع. أبنية الخلوية متميزة من الخلايا الطرفية، جنبا إلى جنب مع سهولة عن طريق التحليل الجيني التي يمكن أن يؤديها في ذبابة الفاكهة، وجعل هذه الخلايا نموذج F ممتازأو التحقيق في آليات ثمرة الخلوية، المتفرعة، وتشكيل أنبوب داخل الخلايا. وقد أثبتت الخلايا محطة نموذجا مفيدا لفهم بعض مسارات الإشارات المؤدية إلى تمايز الخلية متفرعة، ثمرة، ونضوج 2-4. باستخدام هذا النظام غير متحيز، وقد أجريت شاشات الوراثية إلى الأمام بالنسبة المسوخ التشكل الخلية، مما أسفر عن نظرة ثاقبة آليات السيطرة على شكل الخلية 5،6. على سبيل المثال، فقد كشفت هذه الشاشات أن RabGAP محددة مطلوب لقطبية هيكل الخلية والاتجار حويصلة في تشكيل التجويف وتحديد المواقع (7)؛ أن التصاق إنتغرين بوساطة مطلوب من أجل الاستقرار فرع 8، وأن البروتينات PAR-قطبية الظهارية تنظيم الاتجار غشاء الاستقطاب المطلوبة لكلا المتفرعة وتشكيل التجويف 9. وقد أظهرت دراسات أخرى في الخلايا الطرفية التي تراكم أكتين غير المتماثلة وتنظيم أنيبيب مطلوب للاستطالة الخلية وlumenogenesis <sتصل&gt; 10. وهكذا، وآليات متنوعة، الخلية المحمية البيولوجية تسهم في محطة التشكل الخلية. هنا، نحن تصف طريقة لإصلاح بسرعة سليمة، الطور الثالث يرقات ذبابة الفاكهة لتحليل محطة خلية المتفرعة وتشكيل التجويف. ويمكن أيضا أن يتم هذا البروتوكول خارجا على الحيوانات على حد سواء الطور الأول والثاني. المفتاح لهذه التقنية هو القدرة على تصور الخلايا الطرفية التي وصفت وراثيا بواسطة فلوري بروتين تعبير مباشرة من خلال إهاب اليرقات من الحيوانات سليمة. لأن هذا الإجراء لا يتطلب أي تلاعب في مرحلة ما بعد التثبيت، مثل تلوين الأجسام المضادة، لمراقبة الخلايا، فإنه هي مناسبة تماما لتحليل إنتاجية عالية، بما في ذلك الفحص الجيني أو المخدرات. فلوري بروتين تعبير يكشف عن هيكل من الفروع cytoplasmically مليئة. يمكن رصدها تشكيل أنبوب بالتوازي باستخدام المجهر brightfield لتحديد التجويف مليئة بالغاز، الذي يتناقض مع السوائل المحيطة ملءالأنسجة إد. المدرجة في هذا البروتوكول هو طريقة لتوليد الفسيفساء الجينية على أساس نظام MARCM 11، لإنتاج خلايا متماثلة اللواقح محطة متحولة المسمى مع البروتينات الفلورية في الحيوانات غير المسماة خلاف ذلك. وهذا أمر ضروري، لأن الخلايا الطرفية وضع فقط هياكلها المعقدة في وقت متأخر نسبيا في التنمية؛ الفسيفساء الوراثية تسمح لتجاوز متطلبات الجينات في الأنسجة الأخرى في مجال التنمية في وقت سابق. . لتوليد الحيوانات المستنسخة MARCM، وصفت القصبة الهوائية باستخدام برنامج تشغيل القصبة الهوائية محددة لاهث (زجاجة) 12 صفها هنا هو بروتوكول لذبابة الفاكهة كروموسوم X؛ للصبغيات أخرى، إجراء مماثل يمكن استخدامها، مع الكواشف الجينية المناسبة للكروموسوم يجري فحصها. هنا، وصفت القصبة الهوائية عن طريق التعبير عن GFP المترجمة cytoplasmically، ولكن هذا الإجراء يعمل بشكل جيد على قدم المساواة مع التعبير عن البروتينات الفلورية الأخرى، مثل DsRed. بالإضافة إلى ذلك، أدرجنا طريقة لقياس أنماط المتفرعة وتشكيل التجويف في الخلايا الطرفية، على أساس الطرق وضعت لوصف أنماط فرع العصبية 13. هذا النوع من البيانات الكمية يمكن أن تكون حاسمة في المميزين الدور الدقيق للجينات في عملية التفرع أو lumenogenesis، فضلا عن السماح لإجراء مقارنات مباشرة بين المسوخ مختلف 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

شكل الخلية أمر بالغ الأهمية لوظيفة الخلية. ومع ذلك، على الرغم من أهمية مورفولوجيا الخلايا، لا يعرف إلا القليل حول كيفية الخلايا الفردية توليد الأشكال محددة. ذبابة الفاكهة الخلايا محطة القصبة الهوائية أصبحت نموذجا الوراثية قوية لتحديد وتوضيح دور كل من الجينات المطلوبة لتوليد الأشكال التضاريسية الخلوية. الخلايا محطة هي مكون من مكونات شبكة أنبوبية متفرعة، ونظام القصبة الهوائية الذي يعمل على توريد الأكسجين إلى الأنسجة الداخلية. الخلايا محطة هي نموذج ممتاز للتحقيق في الأسئلة من شكل الخلية كما أنها تمتلك اثنين من أبنية الخلوية متميزة. أولا، خلايا محطة لها مورفولوجيا متفرعة تفصيلا، على غرار الخلايا العصبية المعقدة، وثانيا، يتم تشكيل فروع الخلية محطة وأنابيب رقيقة وتحتوي على تجويف داخل الخلايا غشاء محدد. التحليل الكمي من محطة الخلية رقم الفرع، تنظيم فرع وشكل فرع الفردية، ويمكن استخدامها لتقديم معلومات حول دور الميكانيكية وراثية محددةanisms في صنع خلية متفرعة. تحليل تشكيل أنبوب في هذه الخلايا يمكن أن تكشف عن آليات الحفظ من tubulogenesis مشتركة لشبكات أنبوبي الأخرى، مثل الأوعية الدموية الفقارية. نحن هنا وصف التقنيات التي يمكن استخدامها لإصلاح بسرعة، صورة، وتحليل كل أنماط المتفرعة وتشكيل أنبوب في الخلايا الطرفية داخل يرقات ذبابة الفاكهة. هذه التقنيات يمكن استخدامها لتحليل الخلايا الطرفية في البرية من نوع ومتحولة الحيوانات، أو الفسيفساء الوراثية. بسبب الكفاءة العالية من هذا البروتوكول، وأيضا مناسبة تماما لأنها وراثية، المستندة إلى رني، أو شاشات المخدرات في النظام القصبة الهوائية ذبابة الفاكهة.

وتظهر النتائج في الشكل 2. مجموعة الوحشي واحدة (LG) خلية محطة يظهر المتفرعة التحت خلوية واسعة النطاق (تصور من قبل GFP؛ A) والتجويف التحت خلوية مليئة بالغاز من خلال تشغيل كل فرع من الفروع (تصور من قبل المجهري brightfield؛ B). وقد جمعت هذه الصور من فسيفساء L3 يرقة، تم إنشاؤها...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

هنا، نقدم طريقة لتحليل المجهر الضوئي للخلايا القصبة الهوائية في محطة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات. هذا الأسلوب يسمح للفحص السريع للفرع والتشكل التجويف في الحيوانات كلها وسيكون من المفيد تحليل المسوخ الفردية أو شاشات لالطفرات التي تؤثر على تطور الخلايا الطرفية.

فحص<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الخلايا الطرفية الرغامي بواسطة المجهر الضوئي

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

تشريح الجهاز العصبي المركزي اليرقات في Melanogaster ذبابة الفاكهة

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

ذبابة الفاكهة تشريح اليرقات NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

إعداد ذبابة الفاكهة خلايا S2 الميكروسكوب لايت

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

تشريح وتلون ذبابة الفاكهة اليرقات المبايض

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

قياس اليرقات آخر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مراقبة النشاط

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

فحص الديناميات النووية الخميرة الانشطارية الميتومية وMeiotic عن طريق الفلورة الخلية الحية المجهرية

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

الفحص الضوئي القائم علي الضوء لتحليل دروتواكسيس

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...