Name: examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy
Uploaded: 2013-07-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

Мы благодарим Джиллиан Stanfield замечания по рукописи. Таджикистан при поддержке Университета штата Юта генетики Обучение Грант T32-GM007464 от NIGMS NIH.

1. Мозаика поколения <ol><li> Генетические Креста W FRT 19А ванна: GAL80 ФЛП 122 / Y; BTL-GAL4, UAS-GFP (мужчины) X * FRT 19А / Бал (женщины), где * представляет собой мутанта, подлежащих рассмотрению. Примечание: Настройка пересечь по крайней мере за один день до экспер...

<ol>
	<li>Manning, G., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+Tracheal+System.">Development of the Drosophila Tracheal System.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).</li><li>Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+regulation+of+airway+branching+in+Drosophila+is+mediated+by+branchless+FGF.">Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF.</a> Cell. 99 (2), 211-220 (1999).</li><li>Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+interactions+among+epithelial+cells+during+tracheal+branching+morphogenesis.">Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis.</a> Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).</li><li>Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Zpr1+(Zinc+Finger+Protein+1)+Is+Required+Downstream+of+Both+EGFR+And+FGFR+Signaling+in+Tracheal+Subcellular+Lumen+Formation.">Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation.</a> PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).</li><li>Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+screen+for+tube+morphogenesis+and+branching+genes+in+the+Drosophila+tracheal+system.">A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system.</a> PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).</li><li>Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonal+genetic+screen+for+mutants+causing+defects+in+larval+tracheal+morphogenesis+in+Drosophila.">A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila.</a> Genetics. 176 (4), 2279-2291 (2007).</li><li>Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whacked+and+Rab35+polarize+dynein-motor-complex-dependent+seamless+tube+growth.">Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth.</a> Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).</li><li>Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+talin+and+integrin+genes+are+required+for+maintenance+of+tracheal+terminal+branches+and+luminal+organization.">Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization.</a> Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).</li><li>Jones, T. A., Metzstein, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+for+the+PAR+complex+in+subcellular+morphogenesis+of+tracheal+terminal+cells+in+Drosophila+melanogaster.">A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 189 (1), 153-164 (2011).</li><li>Gervais, L., Casanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+coupling+of+cell+elongation+and+lumen+formation+in+a+single+cell.">In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell.</a> Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+GFP/&#223;-galactosidase+fusion+protein+as+a+marker+for+morphogenesis+in+living+Drosophila.">A nuclear GFP/&#223;-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila.</a> Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).</li><li>Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images.">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).</li><li>Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+autonomy+of+HIF+effects+in+Drosophila:+tracheal+cells+sense+hypoxia+and+induce+terminal+branch+sprouting.">Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting.</a> Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).</li></ol>

Методика фиксации тепла описанный здесь быстрый и удобный инструмент для работы с изображениями дрозофилы личиночной трахеи клетки терминала. Здесь мы используем эту технику, чтобы изучить ветвления и просвет структуру клеток дикого типа. Трахеи клеток, экспрессирующих GFP, движи...

Сотовые форма является критической для функции отдельных клеток в организме, а также клетки, которые функционируют как часть ткани или органа. Мы используем Drosophila трахеи клетки терминал, компонент насекомых дыхательной системы, исследовать молекулярные механизмы, которые участвуют в контроле двух консервативных типов клеточной морфологии: ветвления и образование трубки (lumenogenesis). Терминал клетки расположены на концах сети разветвленных труб, который функционирует для доставки кислорода к внутренним тканям 1 и имеют сложную разветвленную морфология которых зависит от пути FGF сигнализации, которая управляется на местном уровне кислорода в тканях-мишенях 2. Конечные ветви ячейки тонких трубок, с газонаполненными субклеточную просвет проходит через каждого филиала. Различных сотовых архитектур терминал клетки, наряду с легкость, с которой генетический анализ может быть выполнен в Drosophila, делает эти клетки отличный е моделиили следственного механизмов клеточных вырост, ветвление и внутриклеточное образование трубки. Терминал клетки доказали полезной моделью для понимания некоторых сигнальных путей, ведущих к разветвленной дифференцировки клеток, заросли, и созревание 2-4. Используя эту систему объективной, вперед генетический скрининг мутантов клетки морфогенеза были выполнены, что дает информацию о механизмах регуляции клеточного формы 5,6. Например, эти экраны показали, что конкретный RabGAP требуется для цитоскелета полярности и везикул в просвете формирования и позиционирование 7; что интегрин-опосредованную адгезию требуется для ветви стабильность 8, и что эпителиальные PAR-полярность белки регулируют поляризованный торговли мембраны требуется для ветвления и формирования просвета 9. Другие исследования в терминале клетках показали, что асимметричный накоплению актина и организации микротрубочек необходима для удлинения клеток и lumenogenesis <sдо&gt; 10. Таким образом, разнообразные, консервативные клетка биологические механизмы способствуют терминала морфогенеза клетки. Здесь мы описываем способ быстро исправить нетронутыми третьего возраста личинок Drosophila для анализа клеммой элемента ветвления и образование просвета. Этот протокол также может быть выполнена на обоих первом и втором животных возрастной стадии. Ключ для этого метода является возможность визуализации терминал клетки, генетически меченных флуоресцентными экспрессии белка непосредственно через личиночной кутикулы интактных животных. Так как эта процедура не требует никакой последующей фиксацией манипуляций, таких как окрашивание антител, наблюдать клетки, он хорошо подходит для высокопроизводительного анализа, в том числе генетические или скрининга лекарственных средств. Флуоресцентные экспрессии белка раскрывает структуру цитоплазматически заполненные ветвей. Образование трубки можно отслеживать в режиме параллельного использования светлого микроскопии для идентификации газонаполненных просвета, который контрастирует с окружающей жидкостью заполненияЭд тканей. В этом протоколе является способ генерации генетической мозаики на основе системы MARCM 11, для производства гомозиготных мутантных клеток терминал меченных флуоресцентными белков в противном случае немеченого животных. Это необходимо, так как терминал клетки только разработать свои сложные структуры относительно поздно в процессе развития; генетической мозаики позволяют обход требований гена в других тканях ранее в развитии. . Для генерации MARCM клонов, трахеи помечены использованием трахеи конкретного драйвера дыхание (бут) 12 Описанный здесь протокол для хромосомы Drosophila X, для других хромосом, аналогичная процедура может быть использована, с генетическими реагентов соответствующей хромосоме быть рассмотрены. Здесь, трахеи помечены путем экспрессии цитоплазматически локализованных GFP, но процедура работает одинаково хорошо с экспрессией другие флуоресцентные белки, такие как DsRed. Кроме того, мы включили метод для количественного ветвящиеся структуры и формирования в просвете терминала элементы на основе методов, разработанных для характеристики моделей нейронных филиал 13. Этот вид количественных данных может иметь решающее значение в плане определения точной роли генов в процессе разветвления или lumenogenesis, а также позволяет прямое сравнение различных мутантов 9.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioImager M1 compound microscope (or equivalent)</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Glycerol</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>M152-4L</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly stock</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Genotype: y w FRT19A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of drosophila larval tracheal terminal cells by light microscopy

Сотовые формы имеет решающее значение для функции клеток. Однако, несмотря на важность морфологии клеток, очень мало известно о том, как отдельные клетки производят конкретные формы. Трахеи клетки Drosophila терминала стали мощным генетическая модель для определения и выяснения роли генов, необходимых для создания сотовой морфологии. Терминал клетки являются составной частью разветвленных трубчатых сети, трахеи система, которая функционирует для подачи кислорода к внутренней ткани. Терминал клетки являются прекрасной моделью для исследования вопросов формы клеток, поскольку они обладают двух различных сотовых архитектур. Во-первых, терминал клетки имеют сложную разветвленную морфологии, похож на комплекс нейронов, во-вторых, конечные ветви клетки образуются в тонких трубок и содержат мембраны внутриклеточных просвет. Количественный анализ выводом элемента номер ветви, отраслевой организации и индивидуальные формы филиал, могут быть использованы для предоставления информации о роли специфических генетических мехамов в создании разветвленной клетки. Анализ трубка образование в этих клетках может выявить консервативные механизмы тубулогенез общими для других трубчатых сетей, таких как позвоночные сосудистой сети. Здесь мы опишем методы, которые могут быть использованы для быстро исправить, изображений и проанализировать как ветвящиеся структуры и образование трубки в терминале клеток внутри личинки дрозофилы. Эти методы могут быть использованы для анализа терминал клетки дикого типа и мутантных животных, или генетических мозаик. Из-за высокой эффективности этого протокола, он также хорошо подходит для генетических, на основе РНК-интерференции, или наркотики экранов у дрозофилы трахеи системы.

Результаты показаны на рисунке 2. Одной боковой группы (LG) терминала ячейка показывает обширную субклеточную ветвления (визуализировали GFP;) и газонаполненные субклеточную просвет проходит через каждую из ветвей (изучались под микроскопом светлое, б). Эти изображения были собр...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy at JoVE.com

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Здесь мы представляем метод для легкого анализа микроскопии клетки трахеи терминала в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок. Этот метод позволяет быстро экспертизы отраслевых и просвета в целом морфология животных и было бы полезно для анализа отдельных мутантов или экраны для мутаций, влияющих на развитие терминала клетки.

Экспертиза<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинок трахеи Клетки терминала с помощью световой микроскопии

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

Препарирование личинок ЦНС у дрозофилы

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

Дрозофилы личинок NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Дрозофилы личинок NMJ Immunohistochemistry

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Preparation of Drosophila S2 cells for Light Microscopy

Подготовка Drosophila S2 клеток для световой микроскопии

The ideal experimental system would be cheap and easy to maintain, amenable to a variety of techniques, and would be supported by an extensive literature ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Разбор и Окрашивание Drosophila Личинок Яичники

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Measurement of Larval Activity in the Drosophila Activity Monitor

Измерение личинок деятельности в<em&gt; Drosophila</em&gt; Монитор активности

Drosophila larvae are used in many behavioral studies, yet a simple device for measuring basic parameters of larval activity has not been available. This ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

Свет пятно основе анализа для анализа Drosophila Larval Фототаксис

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...