Name: a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents
Uploaded: 2013-08-31T07:00:00
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La asistencia técnica y la instrumentación de la Universidad de Maryland Fondo para el Centro de Cáncer Greenebaum Traslacional Core, especialmente los Dres. Rena Lapidus y Mariola Sadowska, se agradece. El trabajo responsable de la elaboración de este ensayo fue financiado en parte por el NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un Premio al Mérito VA a AP, y por la Universidad de Maryland de cigarrillos fondos de reembolso (CRF) proporcionada a la Marlene y Stewart Centro del Cáncer de Greenbaum.

Varios pasos se llevan a cabo antes de tiempo y varios reactivos se preparan y se almacenan antes del procedimiento: (1) cultivo de células y proteínas de aislamiento, (2) preparación de oligonucleótido, (3) la preparación de placas de 96 pocillos, (4) extracto nuclear durante la noche de incubación. Procedimiento requiere 2 días debido a la incubación durante la noche de la proteína nuclear con oligonucleótidos de ADN. 1. Preparación de Buffers 1.1 aislami...

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	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

Ensayos de unión al ADN se utilizan para medir la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para la unión del ADN incluyen cambio de la movilidad electroforética (EMSA) y 1 inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos basados ​​3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos 4 tales como ensayos quimioluminiscentes 2. La EMSA es no cuantitativa y utiliza radiomarcado (32 P) oligonucleótidos. Estos se...

Ensayos de unión al ADN tienen utilidad en la medición de la capacidad de los factores de transcripción para interactuar con el ADN. Los ensayos para ADN de unión incluyen ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA) que dependen de oligonucleótidos radiomarcados 1 o ensayos de quimioluminiscencia 2. Ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) basadas 3, así como ensayos que emplean formatos de 96 pocillos 4 también se han descrito. Sin embargo, la EMSA es un ensayo de no cuantitativa que requiere el uso de oligonucleótidos radiomarcados. Cuando las proteínas nucleares se asocian con las secuencias específicas de nucleótidos promotora, complejos de unión están retrasados ​​en geles de poliacrilamida y el factor de transcripción específico puede ser validado con una &quot;supershift&quot; anticuerpo. Hemos desarrollado un ensayo de unión de ADN-cuantitativa utilizando un formato de inmunoabsorción ligado a enzimas (D-ELISA), que es capaz de medir la interacción de RUNX2 con secuencias de unión al ADN que corresponden a elementos promotores definidos igenes objetivo n RUNX2. El uso de un anticuerpo anti-RUNX2 proporciona especificidad para el ensayo y la falta de radiomarcador distinguir este ensayo a partir del ensayo de desplazamiento en gel tradicional 5. La detección de complejos de unión es posible con el uso de un anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP), que convierte un sustrato de HRP, tetrametil bencidina (TMB) en un producto coloreado para el análisis espectrofotométrico. El ensayo informado aquí puede incorporar el uso de oligonucleótidos de ADN mutadas como controles y se puede utilizar para la detección de inhibidores competitivos o no competitivos de la unión del ADN. La selección de compuestos antitumorales novedosos también es posible con este ensayo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

Muchos ensayos de unión de ADN-tales como ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), ensayos de quimioluminiscencia, de inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) a base de ensayos, y ensayos basados ​​en pocillos múltiples se utilizan para medir la actividad del factor de transcripción. Sin embargo, estos ensayos son no cuantitativos, carecen de especificidad, pueden implicar el uso de oligonucleótidos radiomarcados, y pueden no ser adaptables para el cribado de inhibidores de la unión del ADN. Por otro lado, el uso de una unión a ADN ensayo cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (D-ELISA), que demuestran las interacciones de proteínas nucleares con ADN utilizando el factor de transcripción RUNX2 que dependen de asociación específica con secuencias de unión al ADN consenso presentes en biotina- oligonucleótidos marcados. Preparación de las células, la extracción de proteína nuclear, y el diseño de oligonucleótidos de doble cadena se describen. Placas de 96 pocillos recubiertas con avidina se fijan con tampón alcalino y se incubaron con las proteínas nucleares en tampón de bloqueo de nucleótidos. Folldebido extenso lavado de las placas, el anticuerpo primario específico y las incubaciones de anticuerpos secundarios son seguidos por la adición de sustrato de peroxidasa de rábano picante y el desarrollo de la reacción colorimétrica. Modo de reacción de parada o un control cinético continuo se utilizaron para medir cuantitativamente la interacción de proteínas con el ADN. Se discuten controles de especificidad apropiadas, incluyendo el tratamiento con IgG no específica o sin proteína o anticuerpo primario. Aplicaciones del ensayo se describen incluyendo su utilidad en la detección de drogas y se discuten los resultados positivos y negativos representativos.

El método D-ELISA es altamente específico para la proteína de unión a ADN designado, siempre y cuando se utiliza un oligonucleótido de doble cadena específica de la secuencia que contiene tres copias del sitio de unión consenso RUNX2 (ACACCA). El anticuerpo primario que reconoce el factor de proteína también aumenta la especificidad. El anticuerpo secundario contiene covalentemente unido a la peroxidasa de rábano picante (HRP) que convierte un sustrato transparente (tetrametil bencidina) en un producto colorea...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Desarrollamos una unión a ADN, ensayo basado en ELISA cuantitativo para medir las interacciones de los factores de transcripción con el ADN. Alta especificidad para la proteína RUNX2 se logró con un oligonucleótido de ADN consenso de reconocimiento y el anticuerpo monoclonal específico. Detección colorimétrica con una reacción anticuerpo-enzima-sustrato acoplado se monitorizó en tiempo real.

Un ensayo cuantitativo para estudiar proteínas: DNA Interacciones, reguladores Descubra transcripcional de la expresión génica, e identificar agentes antitumoral

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

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Investigación

Biología

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