Name: the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma
Uploaded: 2013-07-17T21:00:00
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Células da linha celular SW1353 condrossarcoma foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr. PCW Hogendoorn e Prof Dr. J. Bovée Universidade de Leiden, na Holanda. Agradecemos J. Mestach e G. Wagemans para uma excelente assistência técnica, e G. De Bruyne para o desenho profissional do panorama do nosso protocolo.

Veja a Figura 1 para uma visão geral Material tumoral 1. Obtenção e preparação de amostras de tumor Para a utilização do material do paciente, é necessária a aprovação do Comité de Ética e consentimento informado tem de ser obtida a partir do paciente. <ol><li> Colheita de material representativo (mínimo de 1 cm 3), no momento da intervenção, ou de uma biópsia ou uma ressecção de um sarcom...

<ol>
	<li>Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+data+for+648+patients+with+osteosarcoma+treated+at+one+institution.">Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).</li><li>Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anticancer+drug+sensitivity+and+expression+of+multidrug+resistance+markers+in+early+passage+human+sarcomas.">Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas.</a> Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).</li><li>Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2001.">Cancer statistics, 2001.</a> CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).</li><li>Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterisation+of+a+continuous+human+chondrosarcoma+cell+line,+ch-2879:+Comparative+histologic+and+genetic+studies+with+its+tumor+of+origin.">Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin.</a> Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).</li><li>Taylor, B. S., Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+sarcoma+genomics+and+new+therpeutic+targets.">Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).</li><li>Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoma.">Sarcoma.</a> Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).</li><li>Nielsen, T. O., West, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+gene+expression+into+clinical+cara:+sarcomas+as+a+paradigm.">Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm.</a> Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).</li><li>Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors.">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).</li><li>DeRose, Y. S., Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology,+growth,+metastasis+and+disease+outcomes.">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).</li><li>Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development.">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).</li><li>Bertotti, A., Migliardi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecularly+annotated+platform+of+patient-derived+xenografts+("xenopatients")+identifies+HER2+as+an+effective+therapeutic+target+in+cetuximab-resistant+colorectal+cancer.">A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer.</a> Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).</li><li>Decaudin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+human+tumor+xenografted+models+('tumorgrafts')+for+good+management+of+patients+with+cancer.">Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer.</a> Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+The+next+generation.">Hallmarks of cancer: The next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li><li>Sys, G., Van Bockstal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+grafts+derived+from+sarcoma+patients+tumor+morphology,+viability,+and+invasion+potential+and+indicate+disease+outcomes+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+model.">Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model.</a> Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).</li><li>Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+invasion+and+intramesenchymal+infiltration+of+the+chick+embryo+chorioallantois+by+tumor+cell+lines.">Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines.</a> Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).</li><li>Deryugina, E., Quigly, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+model+systems+to+study+and+visualize+human+tumor+cell+metastasis.">Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).</li><li>Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avascular+and+vascular+phases+of+tumor+growth+in+the+chick+embryo.">Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo.</a> British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).</li><li>Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., D&#252;nker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+ex+ovo+culture+and+ex+ovo+CAM+assay:+how+it+really+works.">Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works.</a> J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).</li><li>Balke, M., Neumann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+characterization+of+osteosarcoma+growth+on+the+chick+chorioallantoic+membrane.">Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane.</a> BMC Research Notes. 3, 58 (2010).</li><li>Hendrix, A., Maynard, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+the+secretory+small+GTPase+Rab27B+on+breast+cancer+growth,+invasion,+and+metastasis.">Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis.</a> Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).</li><li>Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularization+of+normal+and+neoplastic+tissues+grafted+to+the+chick+chorioallantois:+role+of+host+and+preexisting+graft+vessels.">Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels.</a> American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).</li><li>Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+Chorioallantoic+membrane+(CAM)+Assay+as+an+in+vivo+model+to+study+the+effect+of+newly+identified+molecules+on+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis.">Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).</li><li>Vargas, A., Zeisser-Labou&#232;be, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo+and+its+chorioallantoic+membrane+(CAM)+for+the+in+vivo+evaluation+of+drug+delivery+systems.">The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).</li><li>Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model.">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).</li><li>De Wever, O., Hendrix, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+and+quantification+of+cancer+cell+invasion+through+collagen+type+I+matrices.">Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices.</a> International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).</li><li>Albini, A., Benelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemoinvasion+assay:+A+method+to+assess+tumor+and+endothelial+cell+invasion+and+its+modulation.">The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation.</a> Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).</li></ol>

Momento da inoculação e da colheita Temporizando no dia da inoculação foi realizada utilizando gel de SAOS2 em ECM (CAMs 36) e variou entre o dia de desenvolvimento embrionário 5 e 10. Antes da incubação dia 9, o CAM não foi consistentemente grande o suficiente para suportar o gel ECM foi aplicado. Na colheita, as células tumorais, por vezes, tinha de ser recuperado do CAM mais profunda, e algumas amostras de gel ECM estavam mentindo solta no albúmen ou no...

Sarcoma é um tumor raro do tecido conjuntivo com uma elevada mortalidade devido à resistência à terapia 1,2. O progresso na sobrevida do paciente é dificultada pela sua baixa incidência anual, sua ampla diversidade, eo fato de que as células do sarcoma são relatados para ser difícil de cultura in vitro 3,4. A utilização de células de cultura para a avaliação pré-clínica terapêutica revelou que novas moléculas, aparentemente activos in vitro nem sempre reflectem os resultados na prática clínica. Além disso, as aberrações genoma reveladas por matrizes de expressão de genes nem sempre são correlacionados às características do comportamento do tumor no doente 5-7. A fim de tentar resolver estes problemas, a medicina personalizada ganhou em importância, o que se reflete no aumento da procura de modelos de xenoenxerto 8-12. Um ensaio in vivo tem a vantagem de refletir a complexa interação entre cAncer células e para o ambiente de tecido do hospedeiro em tumores sólidos, necessários para a proliferação e invasão de 13 cancro. Atualmente, estudar o uso do ensaio de membrana cório-alantóide (CAM-ensaio) como um modelo de xenoenxerto reprodutível para sarcoma 14,15. Este teste é amplamente usado para o estudo da angiogénese tumoral 16,17. Na literatura, no entanto, encontrámos protocolos diferentes para este ensaio, enquanto que outros estudos observada uma marcada diferença no crescimento ou angiogénese de acordo com diferentes protocolos de 18,19. Neste artigo, foi investigado o efeito da variação das condições do ensaio de CAM, no comportamento de células de tumor, utilizando enxertos de suspensões de células únicas derivadas de tumor e culturas de células de sarcoma estabelecidos.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line Nucleofector Kit V</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>VCA-1003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>41965-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11811031</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1270</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse primary monoclonal antibody Ki67</td>
			<td>Dako Denmark</td>
			<td>MIB-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>D76240</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20012019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBSD</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040083</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peGFP-C1 vector</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632470</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140163</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>22409-015</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300054</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vybrant cell-labeling DiI</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>22885</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital color camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC 340 FX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Egg Incubator</td>
			<td>Auto Elex Co</td>
			<td>R-COM 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSAriaIII</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs C-Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-237</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-235</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>semipermeable adhesive film (Suprasorb F)</td>
			<td>Lohmann&amp;Rauscher</td>
			<td>20468</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereo fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Film automated Coverslipper</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>6400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultraView Universal DAB Detection Kit</td>
			<td>Ventana Medical Systems Inc</td>
			<td>760-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ventana Automated Slide Stainer</td>
			<td>Ventana Medical Systems</td>
			<td>Benchmark XT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the in ovo cam-assay as a xenograft model for sarcoma

Sarcoma é uma doença muito rara, que é de natureza heterogénea, toda a impedir o desenvolvimento de novas terapias. Pacientes com sarcoma são candidatos ideais para a medicina personalizada após estratificação, explicando o interesse atual no desenvolvimento de um modelo de xenotransplante reprodutível e de baixo custo para esta doença. A membrana corioalantóide garota é uma série imunodeficientes natural, capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições específicas de cada espécie. Além disso, é facilmente acedido, manipulados e fotografada usando estereomicroscopia óptica e fluorescência. Histologia permite análise mais detalhada das interações celulares heterotípicos. Este protocolo descreve em pormenor o enxerto in ovo da membrana corioalantóica com sarcoma derivados de tecidos frescos de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes (Saos-2 e SW1353). O rato sobrevivência garotaes são de até 75%. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento. Para localizada enxertia de suspensões de células individuais, de ECM de gel proporciona vantagens significativas em relação aos materiais de contenção inertes. O índice de proliferação Ki67 está relacionada com a distância entre as células da superfície da CAM e a duração da aplicação no CAM, este último determina um período de tempo para a adição de produtos terapêuticos.

Avaliação da CAM Enxertos de tumor se tornar aderente à CAM (Figura 2A). As suspensões de células únicas de material paciente frequentemente exibir uma seco, a placa ligeiramente levantada (Figura 2D). Após a excisão da CAM, marcado enrugamento da membrana ocorre (figuras 2E e 2F). Para as linhas celulares comerciais da placa torna-se mais opaca com o tempo, indicando a proliferação de cé...

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The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

O<em&gt; In ovo</em&gt; Membrana corioalantóica (CAM) está enxertado com sarcoma de tecidos frescos derivadas de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento.

O<em&gt; Em ovo</em&gt; CAM-ensaio como um Xenograftmodel para o Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Research

JoVE Journal

Medicine

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

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Medicina

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