Name: visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Gli autori ringraziano Robert Kelsh per gentile condividere il zebrafish reagente promotore SOX10.

1. Embrione Collection per Fotoconversione <ol><li> Impostare almeno dieci coppie di SOX10: Kaede zebrafish transgenico tra il 5 e 6:00 di sera. </li><li> La mattina successiva, tirare divisori e raccogliere le uova intorno a mezzogiorno. Trasferirli su piastre di Petri e metterli in 28,5 ° C incubatore. </li><li> A circa 24 ore dopo la fecondazione, pulire i piatti Petri, eliminando gli embrioni morti. Controllare lo stadio di sviluppo degli embrioni 13 usando la microscopia campo di luce e ogni microscop...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate:+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+(IPDTOC).">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li><li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li><li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting.">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton.">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10:+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model.">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li><li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes,+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning.">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li><li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li><li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you/scube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling.">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development.">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).</li></ol>

Qui è illustrato un nuovo metodo per la visualizzazione di sviluppo craniofacciale nel modello zebrafish. I SOX10: Kaede transgenico linea zebrafish è stato usato con successo per descrivere il modello migratorio di CNCC in dettaglio viene utilizzato come organismo modello 5. Precedenti studi hanno utilizzato i luoghi di interesse lordi come l&#39;occhio alle cellule bersaglio e si sono affidati a iniezione Kaede mRNA, saggi fotoconversione o in gabbia fluoresceina destrano per ...

Schisi oro-facciali rappresentano la deformità cranio-facciale più diffusa, con 1/700-1, 000 consegne interessati 1. Turbativa del primo embrionale sviluppo craniofacciale può portare alla formazione di labio-palatoschisi (CL / P). Mentre cause di schisi sindromica sono stati ampiamente dimostrato, le basi genetiche ed epigenetiche delle forme non sindromiche di clefting orofacciale devono ancora essere scoperti 2-4. Per comprendere l&#39;eziologia e la patogenesi di queste malformazioni, è necessario chiarire lo sviluppo di strutture craniofacciali su base cellulare. In tutte le specie di vertebrati le cellule della cresta neurale cranica (CNCC) migrano dal tubo neurale dorsale per popolare gli archi faringei, che contribuiranno alla formazione di strutture oro-facciale. Turbativa di sviluppo embrionale cresta neurale precoce può portare alla formazione di malformazioni cranio-facciali tra cui CL / P 5-7. In annunciodizione di somiglianze strutturali tra zebrafish e mammiferi sviluppo craniofacciale (CNCCs risiedono in regioni omologhe), la rete di regolamentazione gene è altamente conservata. È stato anche dimostrato che CNCCs evolve allo stesso modo tra specie amniote e zebrafish 8, rendendo il zebrafish un potente organismo per lo studio di base dello sviluppo e genetica di CL / P. Ha molti vantaggi, tra cui piccole dimensioni, rapida ed ex-utero sviluppo embrionale, e di alti tassi di allevamento. Inoltre, l&#39;embrione è otticamente trasparente, rendendolo suscettibile di osservazione di eventi evolutivi complessi sotto il microscopio 9. Si tratta di un modello animale ideale per lo studio della migrazione e differenziazione delle cellule della cresta neurale cranica. Ampliando precedentemente lavoro pubblicato 8, 10, 11, il modello migratorio di CNCC è stato descritto in dettaglio utilizzando le SOX10: kaede modello transgenico 5. Kaede è una proteina foto-convertibile che turns da verde a rosso dopo l&#39;attivazione di foto e permette di tracciare con precisione CNCCs. Durante questa trasformazione il scheletro peptidico viene scisso, suggerendo che la conversione è stabile, cioè le cellule possono essere monitorate per la loro destinazione finale 12. Linee transgeniche etichettati con Kaede sotto il controllo trascrizionale di SOX10 hanno mostrato che il palato amniote e la piastra etmoide di zebrafish sono formate omologo dalla fusione di protuberanze mascellari bilaterali (MXP) con il rilievo frontonasale (FNP) e che la cucitura di fusione a forma di Y è analogo tra specie. Tra le altre applicazioni, i SOX10: Kaede transgenici modello zebrafish è stato utilizzato per generare video di embrioni di zebrafish a diversi stadi di sviluppo di mostrare formazione delle strutture cranio-facciali normali e anormali. Fotoconversione di gruppi specifici di cellule permette di monitorare il loro sviluppo. Con questo metodo un metodo per creare immagini dal vivo di sviluppare craniofacstrutture IAL di zebrafish viene introdotta, rendendo più facile dimostrare visivamente il processo di sviluppo complesso. Questo protocollo è finalizzato a condividere l&#39;esperienza di generare questi video utilizzando il normale sviluppo della piastra etmoide in SOX10: Kaede zebrafish transgenico come esempio. Questo protocollo può essere ulteriormente applicato a fare video time-lapse di qualsiasi struttura derivata da craniche cellule della cresta neurale in zebrafish.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox10: kaede transgenic zebrafish line</td>
			<td>MGH</td>
			<td></td>
			<td>Available via the Liao lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100x15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mmx10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem</td>
			<td>LabTek</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders 200/pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy

Vertebrato palatogenesis è un processo di sviluppo altamente coreografica e complesso, che coinvolge la migrazione di cranica cresta neurale (CNC), le cellule, la convergenza e l&#39;estensione delle protuberanze facciali, e la maturazione dello scheletro cranio-facciale. Per studiare il contributo della cresta neurale cranica a specifiche regioni del palato zebrafish una SOX10: Kaede linea zebrafish transgenico è stato generato. Sox10 prevede la restrizione lignaggio della proteina Kaede giornalista alla cresta neurale, rendendo in tal modo la cella etichettare un processo più preciso di tintura tradizionale o giornalista iniezione di mRNA. Kaede è una proteina foto-convertibile che passa dal verde al rosso dopo l&#39;attivazione foto e permette di seguire con precisione le cellule. I SOX10: Kaede linea transgenica è stato utilizzato per eseguire l&#39;analisi lignaggio di delineare popolazioni di cellule del CNC che danno luogo a mascellare contro elementi mandibolari e illustrano omologia di protuberanze facciali per amnioti. Questo protocollo è descritto il passaggios per generare un time-lapse video live di una SOX10: Kaede zebrafish. Sviluppo della piastra etmoide servirà come esempio pratico. Questo protocollo può essere applicato a una registrazione confocale time-lapse di qualsiasi Kaede o simile proteina reporter fotoconvertibile in zebrafish transgenico. Inoltre, può essere utilizzato per catturare non solo normale, ma anche anormale sviluppo di strutture craniofacciali nei mutanti di zebrafish.

Nel SOX10: CNCCs Kaede linea transgenica, migratori e post-migratori sono etichettati fluorescente verde. Le cellule CNCC etichettati con Kaede fluorescente verde ricapitolano endogena espressione SOX10 mRNA 5. Tra le altre applicazioni, questo modello animale è stato usato per visualizzare meglio lo sviluppo di CNCC strutture craniofacciali dipendenti. Il normale sviluppo di strutture specifiche e anche lo sviluppo patologico di malformazioni cranio-facciali, in particolare il l...

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Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualizzazione dei dati sperimentali è diventata un elemento chiave per la presentazione dei risultati alla comunità scientifica. Generazione di live time-lapse di embrioni in crescita contribuisce a una migliore presentazione e la comprensione dei processi di sviluppo complessi. Questo protocollo è una guida passo-passo per l&#39;etichettatura cellulare tramite fotoconversione di proteine ​​Kaede in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoraggio Actina Smontaggio con Time-lapse Microscopia

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