Name: visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Forfatterne takker Robert Kelsh for vennlig deling sebrafisk sox10 promoter reagens.

En. Embryo Collection for Photoconversion <ol><li> Sett opp minst ti par sox10: kaede transgen sebrafisk mellom 5 og 18:00 i kveld. </li><li> Den neste morgen, trekke skillevegger og samle egg utpå formiddagen. Overfør dem til petriskåler og sette dem inn 28.5 ° C inkubator. </li><li> På rundt 24 timer etter befruktning, rengjøre petriskåler ved å fjerne døde embryoer. Sjekk utviklingsstadiet av embryoer 13 ved hjelp av lys felt mikroskopi og fluorescerende mikroskop med forbedret grønt fluorescer...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate:+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+(IPDTOC).">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li><li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li><li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting.">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton.">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10:+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model.">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li><li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes,+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning.">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li><li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li><li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you/scube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling.">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development.">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).</li></ol>

Her en ny metode for visualisering av kraniofaciale utvikling i sebrafisk-modellen vises. De sox10: kaede transgen sebrafisk linje har blitt brukt for å beskrive den vandrende mønster av CNCC i detalj er brukt som modellorganisme fem. Tidligere studier har brukt brutto landemerker som øyet å målrette celler og har stolt på kaede mRNA injeksjon, photoconversion analyser eller bur fluorescein dekstran for photoconversion 10, 11, 14, 15 Sox:. 10 kaede transgen linje ...

Orofacial kløfter representerer den mest utbredte kraniofaciale misdannelse, med 1/700-1, 000 leveranser påvirket en. Forstyrrelse av tidlig embryologisk kraniofaciale utvikling kan føre til dannelse av leppe-og ganespalte (CL / P). Mens årsaker til syndrom kløft har vært i stor grad vist, genetiske og epigenetiske baser av nonsyndromic former for orofacial clefting fortsatt trenger å bli avdekket 2-4. For å forstå den etiologi og patogenese av disse deformasjoner, er det nødvendig å klargjøre utvikling av craniofacial strukturer på cellebasis. I alle virveldyr arter hjerne neural crest cellene (CNCC) migrere fra dorsal nevralrøret å fylle svelg buer, som vil bidra til dannelsen av orofacial strukturer. Forstyrrelse av tidlig embryologisk neural crest utvikling kan føre til dannelse av kraniofaciale misdannelser inkludert CL / P 5-7. I annonsendition til strukturelle likheter mellom sebrafisk og pattedyr kraniofaciale utvikling (CNCCs bor i homologe regioner), er genet regulatoriske nettverk svært konservert. Det har også blitt vist at CNCCs utvikles på samme måte mellom amniote arter og sebrafisk 8, noe som gjør en kraftig sebrafisk organisme for studiet av utviklings-og genetiske basis av CL / P. Det har mange fordeler, blant annet liten størrelse, rask og ex-utero embryoutvikling, og høye reproduksjons. Videre er embryo optisk transparent, slik at det er mottagelig for observasjon av komplekse utviklingshendelser i mikroskop 9.. Det er en ideell dyremodell for studiet av migrasjon og differensiering av kranie neural crest cellene. Utvider på tidligere publiserte arbeider 8, 10, 11, den vandrende mønster av CNCC ble beskrevet i detalj ved hjelp av sox10: kaede transgen modell 5. Kaede er en foto-konvertible protein som tuRNS fra grønt til rødt etter fotoaktivering og gjør det mulig å spore CNCCs presist. I løpet av denne transformasjonen peptid ryggrad spaltes, noe som tyder på at konverteringen er stabil, noe som betyr at cellene kan spores til sin endelige destinasjon 12. Transgene linjer merket med kaede henhold transcriptional kontroll av sox10 viste at amniote gane og ethmoid plate av sebrafisk er dannet homologously ved fusjon av bilaterale overkjevens prominenser (MXP) med frontonasal prominens (FNP) og at Y-formet fusjon søm er analogt mellom arter. Blant andre programmer, de sox10: ble kaede transgen sebrafisk modell brukes til å generere videoer av sebrafisk embryo på ulike utviklingsstadier vise dannelsen av normale og unormale kraniofaciale strukturer. Photoconversion av spesifikke grupper av celler gjør det mulig å følge utviklingen av disse. Med denne metoden en tilnærming for å skape levende avbildning av å utvikle craniofacial strukturer i sebrafisk er innført, noe som gjør det enkelt å visuelt demonstrere dette komplekset utviklingsprosess. Denne protokollen er rettet mot å dele opplevelsen av å generere disse videoene ved hjelp av den normale utviklingen av ethmoid plate i sox10: kaede transgen sebrafisk som et eksempel. Denne protokollen kan videre brukes til å lage time-lapse videoer av noen struktur avledet fra kranie neural crest cellene i sebrafisk.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox10: kaede transgenic zebrafish line</td>
			<td>MGH</td>
			<td></td>
			<td>Available via the Liao lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100x15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mmx10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem</td>
			<td>LabTek</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders 200/pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy

Virveldyr palatogenesis er en svært koreograferte og komplekse utviklingsprosess, som innebærer flytting av kranie neural crest (CNC) celler, konvergens og utvidelse av ansikts prominenser, og modning av kraniofaciale skjelettet. Å studere bidraget fra kranie neural crest til spesifikke regioner av sebrafisk ganen en sox10: kaede transgen sebrafisk linjen ble generert. Sox10 gir lineage begrensning av kaede rapportørprotein til neural crest, og dermed gjøre cellen merking en mer nøyaktig måte enn ved tradisjonell fargestoff eller reporter mRNA injeksjon. Kaede er en foto-konvertible protein som svinger fra grønt til rødt etter bilde aktivering og gjør det mulig å følge celler presist. De sox10: kaede transgene linjer ble brukt til å utføre avstamning analyse for å avgrense CNC celle populasjoner som gir opphav til overkjevens versus underkjevens elementer og illustrerer homologi av ansikts prominenser til amniotes. Denne protokollen beskriver trinns for å generere en live time-lapse video av en sox10: kaede sebrafisk embryo. Utvikling av ethmoid plate vil fungere som et praktisk eksempel. Denne protokollen kan brukes til å lage en time-lapse confocal opptak av noen kaede eller lignende photoconvertible reporter protein i transgen sebrafisk. Videre kan den brukes til å fange opp ikke bare normalt, men også unormal utvikling av craniofacial strukturer i sebrafisk mutanter.

I sox10: kaede transgen linje, trekkende og etter trekkende CNCCs er merket fluorescerende grønne. CNCC celler merket med grønt fluorescerende kaede rekapitulere endogen sox10 mRNA uttrykk fem. Blant andre programmer, ble denne dyremodell som brukes for å bedre visualisere utviklingen av CNCC avhengige kraniofaciale strukturer. Normal utvikling av konkrete strukturer og også patologisk utvikling av kraniofaciale misdannelser, spesielt leppe og gane har blitt fanget. En rekke l...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualisering av eksperimentelle data har blitt et sentralt element i å presentere resultatene til det vitenskapelige samfunn. Generering av levende intervallopptak av voksende embryo bidrar til bedre presentasjon og forståelse av komplekse utviklingsprosesser. Denne protokollen er en steg-for-steg guide til celle merking via photoconversion av kaede protein i sebrafisk.

Visualisering av Kraniofacial Development i sox10: kaede Transgenic Sebrafisk linjen ved hjelp av Time-lapse konfokalmikroskopi

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation av kraniofaciale Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Kvantitativ analyse av Random migrasjon av celler ved hjelp av Time-lapse video Mikroskopi

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analysere Kraniofacial Morphogenesis i sebrafisk ved hjelp av 4D konfokalmikroskopi

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Høy oppløsning Time-lapse Imaging og automatisk analyse av mikrotubulidynamikk i levende menneske navleveneendotel Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...