Name: visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy
Uploaded: 2013-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Os autores agradecem Robert Kelsh por gentilmente compartilhar o reagente SOX10 promotor peixe-zebra.

1. De colheita de embriões para Fotoconversão <ol><li> Instituído pelo menos dez pares de SOX10: zebrafish transgênicos Kaede entre 5 e 6:00 da noite. </li><li> Na manhã seguinte, puxe divisores e recolher os ovos em torno de meio-dia. Transfira-os para placas de Petri e colocá-los em 28,5 ° C incubadora. </li><li> Por volta das 24 horas pós fertilização, limpe as placas de Petri, removendo os embriões mortos. Para verificar o estágio de desenvolvimento de embriões 13 usando microscopia de camp...

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+at+Birth+of+Cleft+Lip+With+or+Without+Cleft+Palate:+Data+From+the+International+Perinatal+Database+of+Typical+Oral+Clefts+(IPDTOC).">Prevalence at Birth of Cleft Lip With or Without Cleft Palate: Data From the International Perinatal Database of Typical Oral Clefts (IPDTOC).</a> Cleft Palate Craniofac. J. 48 (1), 66-81 (2011).</li><li>Dixon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (3), 167-178 (2011).</li><li>Mangold, E., Ludwig, K. U., Nothen, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakthroughs+in+the+genetics+of+orofacial+clefting.">Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting.</a> Trends Mol. Med. 17 (12), 725-733 (2011).</li><li>Kimmel, C. B., Miller, C. T., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+morphogenesis+of+the+zebrafish+larval+head+skeleton.">Specification and morphogenesis of the zebrafish larval head skeleton.</a> Dev. Biol. 233 (2), 239-257 (2001).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Fate+Map+of+First+Pharyngeal+Arch+Structures+in+the+sox10:+kaede+Zebrafish+Transgenic+Model.">Embryonic Fate Map of First Pharyngeal Arch Structures in the sox10: kaede Zebrafish Transgenic Model.</a> J. Craniofac. Surg. 23 (5), 1333-1337 (2012).</li><li>Trainor, P. A., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hox+genes,+neural+crest+cells+and+branchial+arch+patterning.">Hox genes, neural crest cells and branchial arch patterning.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (6), 698-705 (2001).</li><li>Schilling, T. F., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segment+and+cell+type+lineage+restrictions+during+pharyngeal+arch+development+in+the+zebrafish+embryo.">Segment and cell type lineage restrictions during pharyngeal arch development in the zebrafish embryo.</a> Development. 120 (3), 483-494 (1994).</li><li>Swartz, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish.">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240 (9), 2204-2220 (2011).</li><li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+Defects+Res.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth Defects Res.</a> C. Embryo Today. 93 (2), 67-114 (2011).</li><li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull.">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132 (17), 3977-3988 (2005).</li><li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133 (6), 1069-1077 (2006).</li><li>Ando, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1993).</li><li>Kawakami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish-secreted+matrix+protein+you/scube2+is+implicated+in+long-range+regulation+of+hedgehog+signaling.">The zebrafish-secreted matrix protein you/scube2 is implicated in long-range regulation of hedgehog signaling.</a> Curr. Biol. 15 (5), 480-488 (2005).</li><li>Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+photoconvertible+proteins+during+zebrafish+development.">Cell tracking using photoconvertible proteins during zebrafish development.</a> J. Vis. Exp. (67), e4350 (2012).</li></ol>

Aqui, um novo método para a visualização de desenvolvimento craniofacial no modelo do peixe-zebra é mostrado. Os SOX10: kaede linha de peixes-zebra transgénicos tem sido usado com sucesso para descrever o padrão de migração de CNCC em detalhe é usado como um organismo modelo 5. Estudos anteriores já haviam utilizado marcos brutas, como o olho às células-alvo e têm contado com injeção mRNA Kaede, ensaios fotoconversão ou enjaulado dextrano fluoresceína para fotocon...

Fendas orofaciais representam a deformidade craniofacial mais prevalente, com 1/700-1, 000 entregas afetadas 1. Rompimento de desenvolvimento craniofacial embrionário precoce pode levar à formação de fissura de lábio e palato (FL / P). Enquanto causas para fenda sindrômica foram amplamente demonstrado, as bases genéticas e epigenéticas de formas não sindrômicas de fissuras orofaciais ainda precisa ser descoberto 2-4. A fim de compreender a etiologia e patogénese destas malformações, é necessário para elucidar o desenvolvimento de estruturas craniofaciais numa base celular. Em todas as espécies de vertebrados células da crista neural cranianos (CNCC) migram do tubo neural dorsal para preencher os arcos da faringe, o que contribuirá para a formação das estruturas orofaciais. Rompimento de desenvolvimento da crista neural embrionária precoce pode levar à formação de malformações craniofaciais incluindo CL / P 5-7. Em anúnciodição de semelhanças estruturais entre peixe-zebra e desenvolvimento craniofacial mamíferos (CNCCs residem nas regiões homólogas), a rede reguladora do gene é altamente conservado. Também tem sido mostrado que CNCCs desenvolver da mesma maneira entre as espécies de peixe-zebra e amniote 8, fazendo com que o peixe-zebra de um organismo poderosa para o estudo da base de desenvolvimento e genética de CL / P. Tem muitas vantagens, incluindo o tamanho pequeno, rápido e ex-utero desenvolvimento embrionário, e as taxas de reprodução de altura. Além disso, o embrião é opticamente transparente, tornando-se passível de observação de eventos complexos de desenvolvimento sob o microscópio 9. É um modelo animal ideal para o estudo de migração e diferenciação de células da crista neural cranianos. Expandindo publicado anteriormente de trabalho de 8, 10, 11, o padrão migratório da CNCC foi descrito em detalhes usando as SOX10: Kaede modelo transgênico 5. Kaede é uma proteína de foto-conversível que turns de verde para vermelho após a ativação de fotos e faz com que seja possível traçar CNCCs precisão. Durante esta transformação da estrutura peptídica é clivada, sugerindo que a conversão é estável, o que significa que as células podem ser rastreados para o seu destino final 12. Linhas transgénicas marcadas com kaede sob o controlo transcricional de SOX10 mostrou que o paladar e a placa amniota etmóide de peixe-zebra são formados por fusão de homologamente saliências maxilares bilaterais (MXP) com a proeminência ITontonasal (FNP) e que a costura de fusão em forma de Y é análoga entre espécies. Entre outras aplicações, as SOX10: kaede modelo transgénico de peixe-zebra foi usado para gerar o vídeo de embriões de peixes-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento para mostrar a formação de estruturas craniofaciais normais e anormais. Fotoconversão de grupos específicos de células faz com que seja possível acompanhar o seu desenvolvimento. Com este método de abordagem para criar imagens em tempo real de desenvolver craniofacestruturas ial em peixe-zebra é introduzida, tornando mais fácil para demonstrar visualmente esse processo complexo de desenvolvimento. Este protocolo destina-se a partilhar a experiência de gerar esses vídeos usando o desenvolvimento normal da placa etmoidal em SOX10: zebrafish transgênicos Kaede como exemplo. Este protocolo pode ainda ser aplicada a fazer vídeos de lapso de tempo de qualquer estrutura derivadas de células da crista neural cranial em peixe-zebra.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sox10: kaede transgenic zebrafish line</td>
			<td>MGH</td>
			<td></td>
			<td>Available via the Liao lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100x15 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 35 mmx10 mm</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure Low melting point (LMP) Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15517022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab Tek 2 Chamber SlideSystem</td>
			<td>LabTek</td>
			<td>154453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloaders 200/pk</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R Si Confocal Ti series</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements Software AR3.2 64-bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>No Catalog number</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy

Vertebrate palatogenesis é um processo de desenvolvimento altamente coreografada e complexo, que envolve a migração de crista neural craniana (CNC) células, convergência e extensão de proeminências faciais e maturação do esqueleto craniofacial. Para estudar a contribuição da crista neural craniana para regiões específicas do paladar zebrafish um SOX10: Kaede linha zebrafish transgênicos foi gerada. SOX10 fornece restrição linhagem da proteína kaede repórter para a crista neural, tornando assim o processo de marcação de uma célula mais precisa do que a tradicional corante ou injecção de ARNm repórter. Kaede é uma proteína de foto-conversível que muda de verde para vermelho após a ativação da foto e faz com que seja possível seguir as células com precisão. Os SOX10: linha transgênica Kaede foi utilizada para realizar a análise de linhagem para delinear as populações de células CNC que dão origem ao maxilar contra elementos mandibulares e ilustram homologia de proeminências faciais para amniotas. Este protocolo descreve o passos para gerar um vídeo time-lapse ao vivo de um SOX10: embrião de peixe-zebra Kaede. Desenvolvimento da placa etmoidal servirá como um exemplo prático. Este protocolo pode ser aplicado para fazer uma gravação confocal de lapso de tempo de qualquer kaede ou semelhante da proteína repórter em peixes-zebra transgénicos photoconvertible. Além disso, ele pode ser usado para capturar não só o normal, mas também o desenvolvimento anormal de estruturas craniofaciais nos mutantes de peixe-zebra.

No SOX10: CNCCs linhagem transgênica Kaede, migratórias e pós migratórias são rotulados fluorescente verde. As células marcadas com CNCC Kaede verde fluorescente recapitular endógeno expressão de mRNA SOX10 5. Entre outras aplicações, este modelo animal foi usado para visualizar melhor o desenvolvimento de estruturas craniofaciais CNCC dependentes. O desenvolvimento normal das estruturas específicas e também o desenvolvimento patológico de malformações craniofaciais...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Visualização de dados experimental tornou-se um elemento-chave na apresentação de resultados para a comunidade científica. Geração de gravação de lapso de tempo ao vivo de embriões de crescimento contribui para uma melhor apresentação e compreensão dos processos de desenvolvimento complexos. Este protocolo é um guia para marcação celular passo-a-passo através de fotoconversão de proteína Kaede no peixe-zebra.

Visualização de Desenvolvimento Craniofacial nas SOX10: Kaede Transgênicos Zebrafish Linha Usando Time-lapse microscopia confocal

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoramento Actina Desmontagem com a Time-lapse Microscopia

Biologia

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Lapso de tempo de imagens de Mitose Depois de Transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

Multicolor imagem em tempo-lapso de Transgênicos Zebrafish: Visualizando Células-Tronco da retina Ativado por Ablação célula-alvo Neuronal

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Eletroporação de Mesênquima Craniofacial

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Análise Quantitativa de Migração aleatória de células usando microscopia de lapso de tempo vídeo

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analisando Craniofacial morfogênese em Zebrafish Usando 4D microscopia confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

De alta resolução de imagem Time-lapse e análise automatizada de microtúbulos Dynamics em Viver umbilical humano Células Endoteliais da Veia

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...