Name: flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction at JoVE.com

نشكر المختبر O&#39;Bryan في UIC للتقييم التجريبي النقدي والمناقشة. وأيد هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية منحة 11SDG5230003 إلى مركز GKC والوطنية للنهوض بالحركة العلوم - مركز UIC للعلوم السريرية وبالحركة المنح UL1TR000050.

1. ترنسفكأيشن الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في اليوم قبل ترنسفكأيشن، والطلاء أقل من الخلايا للالمناعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لالمناعي: في 6 جيدا لوحة، ومعطف زلات غطاء زجاجي (1 لكل بئر) مع 0.02٪ الجيلاتين ع...

<ol>
	<li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+protein-protein+complexes+to+interactomics.">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li><li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li><li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-protein+systems:+beyond+binary+protein-protein+interactions.">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li><li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro.">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li><li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation.">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).</li><li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology.">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li><li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry.">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).</li><li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).</li><li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis.">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li><li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li></ol>

BiFC هو وسيلة بسيطة وحساسة لدراسة التفاعل البروتين البروتين. هذا الأسلوب لا يمكن أن تستخدم لتحديد البروتين البروتين التفاعلات الجديدة، ومع ذلك، وأنها مريحة خاصة لتأكيد التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا ودراسة الخصائص الفنية؛ مثل توطين التحت خلوية من المجمعات ا...

وتقدر 650،000 البروتين البروتين التفاعلات في الوجود في interactome الإنسان، ولعب أدوارا حاسمة في الحفاظ على وظائف الخلية العادية 1،2. وبالاضافة الى المشارك مناعي (CO-IP)، المعيار الذهبي لدراسة التفاعل البروتين البروتين من الخلايا المحللة، العديد من البروتين شظية المقايسات تكامل (PCA) تم تطويرها لتحسين حساسية في الكشف عن تفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا 3. وتشمل تقنيات الرنين فورستر نقل الطاقة (الحنق)، تلألؤ بيولوجي بالرنين نقل الطاقة (BRET)، والتكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) 4،5. ويستند BiFC على جمعية تيسير اثنين من أجزاء من بروتين فلوري (هنا نستخدم فينوس؛ البديل YFP) التي تنصهر فيها كل لإمكانات شريك البروتين التفاعلي (في هذا المثال نستخدم AKAP-LBC وPDE4D3). التفاعل بين اثنين من البروتينات ذات الاهتمام داخل خلايا النتائج في مضان وظيفية، والتي يمكن أن تصور كتبها fالمجهر luorescence باستخدام خلايا حية أو الثابتة 6،7،8. مقارنة PCAs أخرى، BiFC حساس وأقل تحديا من الناحية التقنية، مع القدرة على دراسة توطين الخلوية في الخلايا الحية. والعيب الرئيسي لهذا الأسلوب ولكن هو أنه بمجرد تشكيل، مجمع بروتين فلوري لا يمكن عكسها. ولذلك فإنه ليس طريقة جيدة لدراسة ديناميكية التفاعل البروتين البروتين. في هذه الورقة، ونحن نستخدم BiFC لرسم خريطة للمواقع التفاعل من PDE4D3 مع AKAP-LBC خلال رصد كثافة مضان من كوكب الزهرة. بالمقارنة مع التحليل التقليدي باستخدام المجهر مضان، التي تستغرق وقتا طويلا وتتطلب عمالة مكثفة (إذا لم تنفذ باستخدام آلات مؤتمتة عالية الإنتاجية)، ويوفر التدفق الخلوي تحليل كمي مباشرة الآلاف من الخلايا في السكان غير متجانسة على مدى فترة زمنية قصيرة 9، 10. هنا، من خلال تنفيذ مقارنة جنبا إلى جنب من تحليل تدفق cytometric-BiFC والتقليدية المشارك IP، علينا أن نظهر أن اثنين من مethods توفير بيانات قابلة للمقارنة، ومع ذلك، تدفق تحليل BiFC cytometric هو أقل استهلاكا للوقت ويستخدم أقل من المواد التي قد تكون أكثر فائدة عندما يتم خلايا الفائدة محدودة.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2, F1804</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>16B12, MMS-101R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DM1A, T9026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632569</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6-well tissue culture treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep plasmid purification kit, high speed</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S74337MF</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-36931</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 air-jacketed Incubator</td>
			<td>NuAIR DH autoflow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope LSM510 META</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis and transfer unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan ADP Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction

بين أساليب لدراسة التفاعل البروتين البروتين داخل الخلايا، التكملة الإسفار ثنائي الجزيء (BiFC) هو بسيط نسبيا وحساسة. ويستند BiFC على إنتاج مضان باستخدام اثنين من شظايا غير فلوري من بروتين فلوري (يتم استخدام فينوس، أصفر نيون البديل البروتين، هنا). وتنصهر شظايا فينوس غير الفلورسنت (VN وVC) لاثنين من البروتينات المتفاعلة (في هذه الحالة، AKAP-LBC وPDE4D3)، مما أسفر عن مضان بسبب التفاعل VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 وتشكيل بروتين فلوري وظيفية داخل الخلايا. يوفر BiFC المعلومات على توطين التحت خلوية من المجمعات البروتين وقوة تفاعلات البروتين على أساس كثافة مضان. ومع ذلك، تحليل BiFC باستخدام المجهر لقياس قوة التفاعل البروتين البروتين هو مضيعة للوقت وغير موضوعي إلى حد ما بسبب عدم التجانس في تعبير البروتين والتفاعل. بواسطة اقتران تدفق cytometricتحليل مع منهجية BiFC، وفلوري BiFC البروتين البروتين إشارة التفاعل يمكن قياسها بدقة للحصول على كمية كبيرة من الخلايا في وقت قصير. هنا، علينا أن نظهر تطبيق هذه المنهجية لرسم خريطة المناطق في PDE4D3 التي مطلوبة من أجل التفاعل مع AKAP-LBC. ويمكن تطبيق هذه المنهجية إنتاجية عالية لعوامل الفرز التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.

<html> وتنصهر AKAP-LBC وPDE4D3 بنيات (1B الشكل) إلى VN وشظايا VC، على التوالي. تفاعل AKAP-LBC وPDE4D3 النتائج في وظيفية YFP مضان (الشكل 1A). هنا نستخدم طريقة BiFC إلى خريطة مواقع AKAP-LBC ملزم في PDE4D3. منطقة الحفظ المنبع 1 (UCR1)، منطقة الحفظ المنبع 2 (UCR2) والمنطقة الحفاز (CAT) يتم حفظها بي...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

تحليل تدفق cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء يوفر طريقة الكمية الإنتاجية العالية لدراسة التفاعل البروتين البروتين. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لرسم الخرائط مواقع الربط البروتين ولفحص العوامل التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

أسلوب الإنتاجية العالية عالميا لدراسة مورفولوجية عضية في البيرة س.

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

ثنائي الجزيء الإسفار التكملة (BiFC) الفحص عن البروتين البروتين في خلايا البصل التفاعل باستخدام مدفع الجينات هيليوس

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

الإسفار التكملة ثنائي الجزيء

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

الكشف عن تفاعلات البروتين في النبات باستخدام عبارة الإسفار ثنائي الجزيء المتوافقة التكملة (BiFC) نظام

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...