Name: flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction at JoVE.com

אנו מודים למעבדת O&#39;Bryan בUIC להערכה ניסויית ביקורתית ודיון. עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקאי גרנט 11SDG5230003 למרכז GKC והלאומי לקידום מדע Translational - מרכז UIC למדעים קליניים translational גרנט UL1TR000050.

1. Transfection הסלולרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי היום לפני transfection, תאי ציפוי פחות עבור immunofluorescence. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לimmunofluorescence: בצלחת, מכסה מחליק זכוכית מעיל 6 גם (1 לכל טוב) עם 0.02% ג&#39;לטין על 37 מעלות צלזיוס במשך...

<ol>
	<li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+protein-protein+complexes+to+interactomics.">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li><li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li><li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-protein+systems:+beyond+binary+protein-protein+interactions.">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li><li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro.">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li><li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation.">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).</li><li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology.">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li><li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry.">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).</li><li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).</li><li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis.">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li><li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li></ol>

BiFC הוא שיטה פשוטה ורגישה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. שיטה זו אינה יכולה לשמש כדי לזהות חלבונים אינטראקציות חדשות, לעומת זאת, זה נוח במיוחד כדי לאשר את חלבונים האינטראקציה בתוך תאים וללמוד מאפיינים תפקודיים; כגון לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים, מיפוי של אתרי א...

650,000 אינטראקציות בין חלבונים מוערכות להתקיים בinteractome האנושי, ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על 1,2 פונקציות רגילה של תא. חוץ משיתוף immunoprecipitation (שיתוף ה-IP), את תקן הזהב ללמוד אינטראקציה בין חלבונים מlysate התא, כמה מבחני שלמת בר חלבון (PCA) פותחו כדי לשפר את הרגישות באיתור חלבונים אינטראקציה בתוך תאים 3. טכניקות כוללות העברת פורסטר תהודה אנרגיה (סריג), תהודת העברת אנרגיה פליטת אור (ברט), ושלמת הקרינה bimolecular (BiFC) 4,5. BiFC מבוסס על עמותת הנחייתם של שני שברי חלבון פלואורסצנטי (כאן אנו משתמשים ונוס; גרסת YFP), כי הם כל התמזגו לשותף חלבון אינטראקציה פוטנציאלי (בדוגמה זו אנו משתמשים AKAP-LBC וPDE4D3). אינטראקציה של שני החלבונים של עניין בתוך תוצאות תאים בקרינה פונקציונלית, אשר ניתן דמיינו ידי Fמיקרוסקופיה luorescence או באמצעות תאי חיים או קבועים 6,7,8. בהשוואה לPCAs אחר, BiFC הוא רגיש ופחות מאתגר מבחינה טכנית, עם פוטנציאל ללמוד לוקליזציה הסלולר בתאים חיים. חסרון עיקרי של שיטה זו הוא שיצר עם זאת פעם אחת, לא יכול להיות הפוך מורכב חלבון פלואורסצנטי. לכן זה לא שיטה טובה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים דינמיים. במאמר זה, אנו משתמשים BiFC למפות את האתרים של האינטראקציה עם PDE4D3 AKAP-LBC על ידי ניטור את עוצמות הקרינה של ונוס. בהשוואה לניתוח מסורתי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שהוא גוזל זמן והעבודה אינטנסיבי (אם לא מתבצע באמצעות מכונות אוטומטיות תפוקה גבוהה), cytometry הזרימה מספק ניתוח הכמותי פשוט של אלפי תאים באוכלוסייה הטרוגנית על פני זמן קצר 9, 10. כאן, על ידי ביצוע השוואת Side-by-צד של זרימת ניתוח ושיתוף IP מסורתי cytometric-BiFC, אנו מדגימים כי שתיים מ &#39;ethods לספק נתונים דומים, עם זאת, ניתוח תזרים cytometric BiFC הוא פחות זמן רב ומשתמש בפחות חומר שעשויה להיות שימושיות יותר כאשר תאים של עניין מוגבלים.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2, F1804</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>16B12, MMS-101R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DM1A, T9026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632569</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6-well tissue culture treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep plasmid purification kit, high speed</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S74337MF</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-36931</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 air-jacketed Incubator</td>
			<td>NuAIR DH autoflow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope LSM510 META</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis and transfer unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan ADP Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction

בין שיטות ללימוד אינטראקציה בין חלבונים בתוך תאים, שלמת הקרינה bimolecular (BiFC) היא יחסית פשוטה ורגישה. BiFC מבוסס על הייצור של הקרינה באמצעות שני שברים שאינם ניאון של חלבון פלואורסצנטי (ונוס, גרסת חלבון פלואורסצנטי צהובה, משמש כאן). ברי ונוס ללא ניאון (VN והון סיכון) הם התמזגו לשני חלבוני אינטראקציה (במקרה זה, AKAP-LBC וPDE4D3), מניב הקרינה עקב אינטראקציה VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 וההיווצרות של חלבון פלואורסצנטי פונקציונלי בתוך תאים. BiFC מספק מידע על לוקליזציה subcellular של קומפלקסי חלבונים ואת כוחו של אינטראקציות חלבון המבוססות על עוצמת הקרינה. עם זאת, ניתוח BiFC באמצעות מיקרוסקופ כדי לכמת את כוחו של האינטראקציה בין חלבונים הוא זמן רב ומעט סובייקטיבית בשל ההטרוגניות בביטוי חלבון ואינטראקציה. על ידי צימוד זרימת cytometricניתוח עם מתודולוגיה BiFC, אות ניאון BiFC האינטראקציה בין חלבונים ניתן למדוד במדויק לכמות גדולה של תאים בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים יישום של מתודולוגיה זו כדי למפות אזורים בPDE4D3 הנדרשים לאינטראקציה עם AKAP-LBC. המתודולוגיה תפוקה גבוהה זה יכול להיות מיושם על גורמים המווסתים את הקרנת האינטראקציה בין חלבונים.

<html> PDE4D3 מבנים (איור 1) AKAP-LBC והיו התמזגו לVN ושברי הון סיכון, בהתאמה. אינטראקציה של PDE4D3 תוצאות תפקודית YFP הקרינה (איור 1 א) AKAP-LBC ו. כאן אנו משתמשים בשיטת BiFC לאתרי AKAP-LBC מחייבים המפה בPDE4D3. אזור נשמרים במעלה הזרם 1 (UCR1), באזור נשמרים במעלה הזרם 2 (UCR2) ואזור קטליטי...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular מספק שיטה כמותית תפוקה גבוהה ללמוד אינטראקציה בין חלבונים. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת על אתרי קישור ומיפוי חלבון לסינון גורמים המווסתים את האינטראקציה בין חלבונים.

ניתוח תזרים cytometric של שלמת הקרינה bimolecular: שיטה כמותית תפוקה גבוהה לחקר אינטראקציה בין חלבונים

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

השלמה Fluorescence bimolecular

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

שלב נוזלי זיקה לכידת Assay באמצעות חרוזים מגנטיים ללמוד חלבונים אינטראקציה: דוגמה poliovirus-Nanobody

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...