Name: flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction at JoVE.com

Vi takker O&#39;Bryan lab ved UIC for kritisk eksperimentell evaluering og diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Grant 11SDG5230003 til GKC og National Center for å fremme translasjonell Science - UIC Senter for klinisk og translasjonell Sciences Grant UL1TR000050.

En. Cell Transfection <ol><li> Plate celler dagen før transfeksjon, Plating færre celler for immunfluorescens. <ol><li> For immunfluorescens: I en 6-brønns plate, belegge glass dekkglass (1 per brønn) med 0,02% gelatin ved 37 ° C i minst 4 timer, vaskes en gang med medium, og for hver brønn, platen 1 x 10 5 HEK 293T celler i 2 ml komplett vekstmedium [Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) pluss 10% FBS]. </li><li> For flowcytometrisk og Western blot analyser: plate 1,2 x 10 5 HEK 293T ...

<ol>
	<li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+protein-protein+complexes+to+interactomics.">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li><li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+size+of+the+human+interactome.">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li><li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-protein+systems:+beyond+binary+protein-protein+interactions.">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li><li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades.">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li><li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro.">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+(BiFC)+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells.">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li><li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay.">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li><li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+fluorescence+complementation.">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643 (2011).</li><li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology.">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li><li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry.">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429 (2010).</li><li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11 (2008).</li><li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis.">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li><li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li></ol>

BiFC er en enkel og følsom metode for å undersøke protein-protein interaksjon. Denne metode kan ikke brukes for å identifisere nye protein-protein interaksjoner, er det imidlertid særlig hensiktsmessig å bekrefte protein-protein interaksjon inne i celler og for å studere funksjonelle egenskaper, slik som subcellulære lokalisering av proteinkomplekser, kartlegging av protein-protein interaksjon steder, og for screening av små molekyler / peptider som kan modulere protein-protein interaksjon. Fordi VN og VC-fragm...

650.000 protein-protein interaksjoner er anslått til å eksistere i den menneskelige interactome, spiller viktige roller i å opprettholde normal celle funksjoner 1,2. Foruten co-immunoutfelling (co-IP), for å studere den gull-standarden protein-protein interaksjon fra cellelysat, flere proteinfragment komplementering assays (PCA) er blitt utviklet for å forbedre følsomheten i å oppdage protein-protein interaksjon inne i celler 3. Teknikker inkluderer Förster resonans energi overføring (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), og bimolecular Fluorescens complementation (BiFC) 4,5. BiFC er basert på den forenklede sammenslutning av to fragmenter av et fluorescerende protein (her bruke Venus, en YFP variant) som hver er kondensert til en potensiell interagerende protein partner (i dette eksempelet bruker vi AKAP-Lbc og PDE4D3). Interaksjon av de to proteiner av interesse inne i celler resulterer i funksjonell fluorescens, som kan visualiseres ved fluorescence mikroskopi ved hjelp av enten levende eller faste celler 6,7,8. Sammenlignet med andre PCAS, er BiFC sensitiv og mindre teknisk krevende, med potensial til å studere cellulær lokalisering i levende celler. En stor ulempe med denne teknikken er imidlertid at en gang dannet, kan den fluorescerende protein kompleks ikke reverseres. Derfor er det ikke er en god metode for å studere dynamisk protein-protein interaksjon. I denne artikkelen bruker vi BiFC å kartlegge samspillet områder av PDE4D3 med AKAP-Lbc ved å overvåke fluorescensintensiteter av Venus. Sammenlignet med tradisjonelle analyse ved hjelp av fluorescens-mikroskopi, som er tidkrevende og arbeidskrevende (hvis ikke utført ved hjelp av automatisert maskineri høy gjennomstrømning), gir strømningscytometri en grei kvantitativ analyse av tusener av celler i en heterogen populasjon over en kort tid 9, 10. Her, ved å utføre en side-ved-side-sammenligning av flowcytometrisk analyse-BiFC og tradisjonelle co-IP, viser vi at de to methods gi sammenlignbare data, er imidlertid flowcytometrisk analyse BiFC mindre tidkrevende og krever mindre materiale som kan være mer nyttig når celler av interesse er begrenset.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Flag antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2, F1804</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HA antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>16B12, MMS-101R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-tubulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DM1A, T9026</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP antibody</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632569</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates, 6-well tissue culture treated</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130184</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep plasmid purification kit, high speed</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round-bottom tubes for FACS staining</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S74337MF</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade reagent with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P-36931</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus Microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest premium cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 air-jacketed Incubator</td>
			<td>NuAIR DH autoflow</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope LSM510 META</td>
			<td>Carl Zeiss, Inc</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis and transfer unit</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyan ADP Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric analysis of bimolecular fluorescence complementation: a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction

Blant metoder for å studere protein-protein interaksjon inne i celler, er bimolecular fluorescens complementation (BiFC) relativt enkel og følsom. BiFC er basert på produksjon av fluorescens ved hjelp av to ikke-fluorescerende fragmenter av et fluorescerende protein (Venus, en gul fluorescerende protein variant, blir brukt her). Non-fluorescerende Venus fragmenter (VN og VC) er smeltet til to interagerende proteiner (i dette tilfellet, AKAP-Lbc og PDE4D3), gir fluorescens grunn VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 samhandling og dannelse av et funksjonelt fluorescerende protein inni cellene. BiFC gir informasjon om subcellular lokalisering av protein komplekser og styrken av protein interaksjoner basert på fluorescens intensitet. Imidlertid er BiFC analyse ved hjelp av mikroskopi for å kvantifisere styrken av protein-protein interaksjonen tidkrevende og noe subjektivt på grunn av heterogeniteten i proteinekspresjon og interaksjon. Ved kopling flowcytometriskanalyse med BiFC metodikk, kan den fluorescerende BiFC protein-protein interaksjon signal måles nøyaktig for et stort antall av celler i en kort tid. Her viser vi en anvendelse av denne metodikken for å kartlegge områder i PDE4D3 som er nødvendige for samhandling med AKAP-Lbc. Denne høye gjennomstrømning metodikk kan anvendes til screening av faktorer som regulerer protein-protein interaksjon.

AKAP-Lbc og PDE4D3 konstruksjoner (figur 1B) ble smeltet til VN og VC fragmenter, henholdsvis. Interaksjon av AKAP-Lbc og PDE4D3 resulterer i funksjonelle YFP fluorescens (figur 1A). Her bruker vi BiFC metode for å kartlegge AKAP-Lbc-bindende områder i PDE4D3. Upstream konservert region 1 (UCR1), oppstrøms konservert region 2 (UCR2) og katalytisk region (CAT) er bevart blant PDE4 familie proteiner, derfor full lengde (FL), UCR1 og UCR2 pluss CAT ble brukt til screening bindende områ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction at JoVE.com

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation gir en høy gjennomstrømming kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon. Denne metoden kan brukes til kartlegging proteinbindingsseter og for screening av faktorer som regulerer protein-protein interaksjon.

Flowcytometrisk analyse av bimolecular Fluorescens complementation: En høy gjennomstrømning Kvantitativ metode for å studere protein-protein interaksjon

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

En væskefase Affinity Capture Assay hjelp av magnetiske perler å studere protein-Protein Interaction: Den poliovirus-Nanobody Eksempel

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Kvantitativ analyse av Autophagy med Avansert 3D fluorescens mikroskopi

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En høy gjennomstrømning MHC II Binding Assay for kvantitativ analyse av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Protein-protein interaksjoner visualisert ved bimolekylær fluorescens complementation i Tobakk Protoplaster og blader

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...