Name: live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00
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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse R37 und R01 AI34867 GM064625 zu NWA Wir danken Dr. R. Tweten von der Universität von Oklahoma für die SLO-Expressionsplasmid unterstützt.

1. Transkriptions Silencing von ASM <ol><li> Samen 1,5 x 10 5 HeLa-Zellen in 2 ml DMEM Wachstumsmedium (DMEM mit hohem Glucose mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1% Penn-Strep) auf 35 mm Glasbodenschalen (MatTek) und Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einem 5% CO 2-Inkubator. </li><li> Am folgenden Tag, absaugen dem Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 2 ml DMEM reduziert Serummedium (DMEM mit 4% FBS), mindestens 1 Stunde vor der Zugabe der siRNA-Transfektion Mischung. </l...

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

Frühere Studien über mechanische Verletzungen und Plasmamembran Reparatur verließ sich auf vielfältige Mechanismen der Zellen zu verletzen, die von Fallenglasperlen, Mikropipettiervorrichtung, Scheren, Kratzen oder Schaben. Das Auslesen von all diesen Tests war eher qualitative als quantitative und hat genaue Informationen über die Kinetik der Reparaturmechanismus nicht geben. Die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran nach dieser Formen von Verletzungen verschließen wurde durch die Anwesenheit oder Abwesenheit ...

Es ist seit mehreren Jahrzehnten bekannt, dass die Plasmamembran-Reparatur nach mechanischen Verletzungen ist ein Ca 2 +-abhängigen Prozess 1,2. Spätere Studien zeigten, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Wunde löst eine kräftige Prozess der Exozytose von intrazellulären Vesikeln an der Stelle der Verletzung, die zum Wiederverschließen 3,4 erforderlich ist. Die Verlustrate der Fluoreszenzfarbstoff in das Zytoplasma der Zellen geladen wurde verwendet, um die Geschwindigkeit der Reparatur zu beurteilen und festgestellt, dass Wiederverschließen wurde innerhalb von &lt;30 sec nach der Verletzung 5 abgeschlossen. Zwei Modelle wurden zunächst vorgeschlagen, die Voraussetzung für die Exozytose in Plasmamembran-Reparatur zu erklären: 1) die &quot;Patch&quot;-Modell, das vorgeschlagen, dass Ca 2 +-Einstrom durch die Läsion löst zunächst homotypischen Fusion von intrazellulären Vesikeln, bilden eine große &quot;Patch&quot; Das wäre dann in die Plasmamembran aufgebracht, um die Wunde 6 und 2) die Spannungsreduzierung Modell, das die Membran adde vorgeschlagen werden verschließendurch Ca 2 +-abhängige Exocytose in der Nähe der Wunde d würde Plasmamembranspannung zu verringern und erleichtert Wiederverschließen der Doppelschicht 7. Die Rolle von Ca 2 + ausgelöste Exocytose in der Plasmamembranreparatur wurde durch Studien, die zeigen, dass Lysosomen enthalten eine Ca 2 +-Sensormolekül, synaptotagmin VII, die Exocytose und deren Plasmamembran Reparatur erleichtert verletzten Zellen verstärkt 8,9,10,11 . Allerdings hat zusätzliche Beweise zeigten, dass Exozytose allein war nicht ausreichend, um die Reparatur der Plasmamembran zu fördern. Neben mechanischen Tränen auf der Plasmamembran, ist eine häufige Form von Zellschädigung Permeabilisierung von durch Bakterien oder Immunzellen 12,13 14,15 hergestellt porenbildenden Toxinen. Im Gegensatz zu mechanischen Tränen, porenbildende Proteine, fügen sich auf der Plasmamembran, eine stabile, Protein-Pore gesäumt, die nicht einfach durch die Anwendung einer Membran &quot;Patch&quot; oder durch Reduktion wieder verschlossen werden könnenten Membranspannung. Interessanterweise Studien zeigten, dass Säugerzellen mit einem effektiven Mechanismus, um die Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​zu reparieren, und dieses Verfahren erfordert ebenfalls die Gegenwart von extrazellulärem Ca 2 + 12. Dieser Befund warf die Frage auf, ob Transmembranporen Entfernung von der Zelloberfläche war auch ein schneller Prozess, wie bei mechanischen Wunden 5 beobachtet. Überraschenderweise zeigte unsere jüngste Studien, daß das Wiederverschließen der Zellen, die mit porenbildenden Toxinen permeabilisiert hat sehr ähnliche Eigenschaften wie die Reparatur von mechanischen Wunden: erfordert das Verfahren der extrazellulären Ca 2 +, und wird innerhalb von ~ 30 sec abgeschlossen. Die Untersuchung dieses Prozesses näher wir vor kurzem erfahren, dass zusätzlich zu den Ca 2 +-regulierte Exozytose von Lysosomen, Plasmamembran Reparatur beinhaltet eine schnelle Form der Endozytose, die durch die Freisetzung von lysosomalen Enzym ausgelöst wird, saure Sphingomyelinase (ASM) und ist essentiell nicht nur für the Entfernen der Transmembranporen, aber auch für die Reparatur von mechanischen Verletzungen 16. Um die Kinetik der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildenden Proteinen zu bestimmen, die wir in unserem Labor eine Echtzeit-Bildgebung geeignet Methodik, die zuvor verwendet worden war, um Wiederverschließen der Laser verletzt isolierte Muskelfasern 17 beurteilen. Dieser Assay beruht auf Eigenschaften der lipophilen Farbstoff FM1-43, die stabil interkaliert in die äußere Seite der Lipiddoppelschichten Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Wenn der Plasmamembran-Doppelschicht extrazellulären Farbstoff erhält Zugang zu intrazellulären Membranen gestört, die ein empfindliches Assay Plasmamembran Verletzungen erkennen und reparieren 18,16,19,20. Um diesen Test zur Beurteilung der Zellwiederverschließen nach Permeabilisierung mit porenbildende Proteine ​​anzupassen, wir vorinkubierten Zellen bei 4 ° C mit dem bakteriellen Toxin Streptolysin O (SLO), welche an Membrancholesterin 21 bindet. Synchron-ZellePermeabilisierung kann dann leicht durch Bewegen der Zellen vom Medium, um Eis in einem erwärmten Mikroskoptisch, der die Oligomerisation und Änderung der Konformation, die den Transmembranporenbildung führt aktiviert erwärmen erreicht werden. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise gegenüber den bisher veröffentlichten Untersuchungen mit Laser Verwundung ist, dass eine größere Anzahl von Zellen gleichzeitig in einem mikroskopischen Feld analysiert werden, eine bessere Abtastung der Zellpopulation. Angesichts der Gemeinsamkeiten zwischen der Zellwiederverschließen Prozess nach mechanischen Verletzungen und Permeabilisierung mit porenbildende Toxine zu sehen ist, der Test beschreiben wir hier eine sehr vielseitige und leistungsstarke Methode zum Präparieren Faktoren in der grundlegenden Verfahren der Plasmamembran-Reparatur beteiligt. Als Beispiel zeigen wir, dass es möglich ist, diesen Test zu verwenden, um Ca 2 +-abhängigen und unabhängigen Schritten des Reparaturvorgangs zu identifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Plasma-Membran-Verletzung ist ein häufiges Ereignis, und Wunden müssen schnell repariert, um zelluläre Überleben zu gewährleisten. Einstrom von Ca 2 + ist ein Schlüsselsignalisierungsereignis, das die Reparatur von mechanischen Verletzungen an der Plasmamembran innerhalb von ~ 30 s auslöst. Jüngste Studien zeigten, dass Säugerzellen ihrer Plasmamembran nach Permeabilisierung mit porenbildenden Toxinen in einem Ca 2 +-abhängigen Prozess, der Exozytose des lysosomalen Enzyms saure Sphingomyelinase, gefolgt von Poren Endocytose beinhaltet auch wieder zu verschließen. Hier beschreiben wir die Methodik, um zu zeigen, dass das Wiederverschließen der Zellen durch das Toxin Streptolysin O permeabilisiert ist auch eine schnelle und abhängig von Ca 2 +-Einstrom. Der Assay-Design ermöglicht die Synchronisation der Verletzungsanlaß und eine genaue kinetische Messung der Fähigkeit von Zellen, Plasmamembranintegrität von Abbildungs ​​wiederherzustellen und Quantifizieren des Ausmaßes, mit dem die lipophilen Farbstoff FM1-43 intrazellulären Membranen erreicht. Diese Live-Test ALSo ermöglicht eine sensible Bewertung der Fähigkeit von exogen zugesetzten löslichen Faktoren wie Sphingomyelinase FM1-43 Einstrom hemmen, was auf die Fähigkeit von Zellen, die Plasmamembran zu reparieren. Dieser Assay erlaubt uns zum ersten Mal zeigen, dass Sphingomyelinase wirkt abwärts von Ca 2 +-abhängigen Exozytose, da extrazelluläre Zugabe des Enzyms fördert Wiederverschließen der Zellen in der Abwesenheit von Ca 2 + durchlässig gemacht.

Niedrige Konzentrationen von bakteriellen Sphingomyelinase (SM) Rettungsplasmamembran-Reparatur in Zellen in lysosomalen sauren Sphingomyelinase erschöpft. Verwendung der FM1-43 Abbildungsassay wir früher gezeigt, dass Zellen defizient für das lysosomale Enzym ASM und SLO ausgesetzt Verwundung in Gegenwart von Ca 2 + über einen Plasmamembran-Defekt wird durch extrazelluläre Zugabe des rekombinanten menschlichen Enzyms 19 gerettet. Da das humane lysosomale ASM hat eine...

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Research

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Biology

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