Name: live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00
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この作品は、私たちは、SLO発現プラスミドのためのオクラホマ大学から博士R. Twete​​nに感謝NWAにNIHの助成金R37 AI34867およびR01 GM064625によってサポートされていました。

1。 ASMの転写サイレンシング<ol><li>シード1.5×10 35mmのガラスボトムディッシュ（MatTek社製）上のDMEM増殖培地（10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM高グルコース、2mMのL-グルタミン、1％ペニシリン-ストレプトマイシン）2ml中の5 HeLa細胞および5％CO 2インキュベーター内で37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>翌日、増殖培地をオフ吸引し、siRNAトランスフェクション混合物?...

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

機械的損傷と、細胞膜の修復に関する初期の研究では、ガラスビーズ、マイクロピペット、せん断、傷や削れを落とすに至るまで、負傷した細胞の多様なメカニズムに依存していました。すべてのこれらのアッセイの読み出しは、定性的ではなく定量的であり、修復機構の動力学に関する正確な情報を与えなかった。損傷のこれらの形態の後に原形質膜を再シールする細胞の能力は、細胞質?...

これは、機械的損傷後の血漿膜修復は、Ca 2 +依存性プロセスであること1,2数十年前から知られている。その後の研究は、傷口を通してのCa 2 +流入は、3,4を再密封するために必要とされる傷害の部位で細胞内小胞のエキソサイトーシスの積極的なプロセスをトリガすることが示された。細胞の細胞質内にロード蛍光色素の損失の速度は、修復の速度を評価するために使用され、再封が損傷後5 &lt;30秒以内に完了したと結論された。二つのモデルは、最初は、細胞膜修復にエキソサイトーシスのための要件を説明するために提案された。病変を通じてのCa 2 +流入は、そのだろう大規模な「パッチ」を形成、細胞内小胞の最初に同型の融合を引き起こすことが示唆さ1）「パッチ」モデル、次いで、創傷6と、その膜を提案しADDE 2）張力低減モデルを再シールするために原形質膜に適用すること創傷の近傍におけるCa 2 +依存性エキソサイトーシスによって7日間二重層の再封を容易にする、原形質膜の張力を減少させるであろう。原形質膜修復におけるCa 2 + -誘発さエキソサイトーシスの役割は、リソソームが損傷菌におけるそれらのエキソサイトーシスおよび原形質膜の修復を促進するのCa 2 +センサー分子、シナプトタグミンVIIを含有することを示す研究によって補強された8,9,10,11 。 しかしながら、追加の証拠は、単独で、エキソサイトーシスは、形質膜の修復を促進するのに十分ではなかったことを示した。原形質膜上の機械的な涙液に加えて、細胞損傷の頻繁な形態は、細菌12,13又は14,15免疫細胞によって産生さ孔形成毒素による透過性である。機械的な涙とは違って、孔形成タンパク質は、細胞膜は、膜「パッチ」を適用するか、削減するだけで再密封することはできない、安定した、タンパク質が並ぶ細孔を形成する上で自分自身を挿入膜張力をING。興味深いことに、研究は、哺乳類細胞は孔形成タンパク質を用いて透過処理した後に、それらの原形質膜を修復するための効率的な機構を有することを明らかにし、このプロセスは、細胞外Ca 2 + 12の存在を必要とする。機械的な傷5で観察されたので、この発見は、細胞表面から貫通孔の除去にも迅速なプロセスであったかどうかという疑問を提起した。プロセスは、細胞外Ca 2 +を必要とし、約30秒以内に完了する：驚くべきことに、我々の最近の研究では、孔形成毒素で透過処理した細胞の再シールは、機械的創傷の修復に非常に類似した性質を有することが明らかになった。より詳細には、このプロセスを調査し、我々は最近、リソソームのCa 2 +調節性エキソサイトーシスに加えて、原形質膜の修復は、リソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼ（ASM）の放出によって引き起こさ必須であるエンドサイトーシスの急速な形態を含むことを学ん目のためだけでなく、貫 ​​通孔のEの除去だけでなく、機械的な傷16の補修用。 孔形成タンパク質との透過処理後の細胞再密封の動態を決定するために、我々の研究室では、レーザー損傷孤立筋繊維17の再シール性を評価するために以前に使用されていたライブイメージングの方法論を適応。このアッセイは、安定して蛍光強度が増加した脂質二重層の外側のリーフレット中にインターカレートする親油性色素FM1-43の特性に依存する。ときに、原形質膜二重層を形質膜損傷および修復18,16,19,20を検出するための感度の高いアッセイを提供し、細胞内膜への細胞外の色素アクセスして破壊される。孔形成タンパク質との透過処理後の細胞の再シール性の評価のためにこのアッセイを適合させるために、我々は、膜コレステロール21に結合する細菌毒素ストレプトリジンO（SLO）、4℃で細胞をプレインキュベートした。同期セル透過化は、その後容易に貫通孔の形成をもたらすコンフォメーションの変化をオリゴマー化および活性化する加熱された顕微鏡ステージ、媒体を温めるために氷から細胞を移動させることによって達成することができる。このアプローチの利点は、レーザー創傷を用いて以前に公開されたアッセイの上に、多数の細胞は、細胞集団のより良好なサンプリングを提供し、顕微鏡視野内で同時に分析することができることである。孔形成毒素との機械的損傷および透過後に見られる細胞の再シール工程の間の機構的類似点を考えると、我々はここで説明するアッセイは、細胞膜修復の基本的なプロセスに関与する因子を解剖するために、非常に汎用性と強力な方法を提供する。一例として、我々はそれが修復過程ののCa 2 +依存性および非依存性の手順を識別するために、このアッセイを使用することが可能であることを示している。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

原形質膜の損傷が頻繁なイベントであり、創傷は急速に細胞の生存を確実にするために修復されなければならない。のCa 2 +の流入は、30秒以内〜原形質膜上に機械的な創傷の修復をトリガする重要なシグナル伝達事象である。最近の研究では、哺乳動物細胞はまた、細孔が細孔エンドサイトーシスに続いてリソソーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼのエキソサイトーシスを伴うのCa 2 +依存性プロセスでの毒素の形成に透過処理後に原形質膜を再シールすることを明らかにした。ここでは、毒素ストレプトリジンOにより透過性細胞の再シールは、Ca 2 +流入にも迅速かつ依存していることを示すために使用される方法について説明します。アッセイデザインは、損傷事象および撮像により原形質膜の完全性を復元し、親油性色素FM1-43は細胞内膜に到達することによって程度を定量化する細胞の能力の正確な速度論的測定の同期を可能にする。このライブアッセイALSoは外因的能力の評価は、それらの感受性形質膜を修復する細胞の能力を反映して、FM1-43の流入を抑制するために、例えばスフィンゴミエリナーゼのような可溶性因子を添加することができる。このアッセイは、私たちは、酵素の細胞外のほかは、Ca 2 +が存在しない場合に透過性細胞の再シールを促進するため、スフィンゴミエリナーゼは、カルシウム2 +依存性エキソサイトーシスの下流で作用することを初めて示すことができました。

リソソーム酸性スフィンゴミエリナーゼで枯渇細胞における細菌スフィンゴミエリナーゼ（SM）レスキュー形質膜修復の低濃度。 FM1-43画像化アッセイを用いて、我々は、以前のCa 2 +の存在下での創傷のリソソーム酵素ASM欠損とSLOに曝露された細胞は、原形質膜の欠陥は、組換えヒト酵素19の細胞外添加によりレスキューされていることを示した。ヒトリソ?...

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

親油性色素FM1-43に曝露された細胞のライブイメージングは​​、孔形成毒素は原形質膜から除去されることにより、反応速度の正確な決定を可能にする。これは、Ca 2 +、スフィンゴミエリナーゼおよび原形質膜の修復に関する他の要因のための要件を評価するために使用できる高感度のアッセイである。

カルシウムの役割を評価するためのイメージングアッセイを生きる<sup&gt; 2 +</sup孔形成毒素の傷の修復&gt;とスフィンゴミエリナーゼ

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

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