Name: live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd R37 AI34867 og R01 GM064625 til NWA Vi takker Dr. R. Tweten fra University of Oklahoma for SLO ekspresjonsplasmid.

En. Transcriptional stanse av ASM <ol><li> Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM vekstmedium (DMEM høy glukose med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glassbunn retter (Mattek) og Inkuber over natten ved 37 ° C i en 5% CO 2 inkubator. </li><li> På den påfølgende dagen, aspirer av vekstmedier og erstatte den med 2 ml DMEM redusert serum medium (DMEM med 4% FBS), minst en time før du legger den siRNA transfeksjon blanding. </li><li> Forbered fire rør f...

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

Tidligere studier på mekanisk skade og plasma membran reparasjon stolt på ulike mekanismer for å skade celler, alt fra slippe glassperler, micropipetting, klipping, riper eller skraper. Avlesning av alle disse analysene var kvalitativ snarere enn kvantitativ, og ikke gi presis informasjon om kinetikken av reparasjonsmekanismen. Muligheten av celler for å forsegle deres plasma membran etter at disse former for skade ble målt i nærvær eller fravær av sporstoff tilsatt i ekstracellulær væske i cytoplasma, gjennom...

Det har vært kjent i flere tiår at plasma membran reparasjon etter mekanisk skade er en Ca 2 +-avhengig prosess 1,2. Senere studier viste at Ca 2 + tilstrømningen gjennom såret utløser en kraftig prosess med eksocytose av intracellulære vesikler på stedet av skader, noe som er nødvendig for forsegles 3,4. Satsen for tap av et fluorescerende fargestoff lastet inn i cytoplasma av celler ble brukt til å vurdere hastigheten på reparasjon, og konkluderte med at forsegles ble fullført innen &lt;30 sek etter skade fem. To modeller ble opprinnelig foreslått å forklare behovet for eksocytose i plasma membran reparasjon: 1) &quot;patch&quot;-modellen, som antydet at Ca 2 + tilstrømningen gjennom lesjonen utløser i utgangspunktet homotypic fusjon av intracellulære vesikler, danner en stor &quot;patch&quot; som ville deretter brukes på plasmamembranen til å forsegle såret 6 og 2) å redusere spenningen modellen, som foreslått at membranen added av Ca 2 +-avhengige exocytose i nærheten av såret ville redusere plasma membran spenning, tilrettelegging forsegles av bilayer 7.. Rollen av Ca 2 +-utløst eksocytose i plasma membran reparasjon ble ytterligere forsterket av studier som viser at lysosomes inneholde en Ca 2 + sensor molekyl, synaptotagmin VII, som forenkler deres eksocytose og plasma membran reparasjon i skadde celler 8,9,10,11 . Imidlertid har ytterligere bevis indikerte at exocytose alene ikke var tilstrekkelig for å fremme plasma membran reparasjon. I tillegg til mekaniske tårer på plasmamembranen, er en vanlig form for celleskade permeabilization av poredannende toksiner produsert av bakterier 12,13 eller immunceller 14,15. I motsetning til mekaniske tårer, pore-dannende proteiner som setter seg på plasmamembranen danner en stabil, protein-foret porer som ikke kan lukkes igjen ved å anvende en membran &quot;patch&quot; eller ved reduksjoning membran spenning. Intriguingly studier vist at pattedyrcellene har en effektiv mekanisme for å reparere deres plasma membran etter permeabilization med pore-dannende proteiner, og denne prosessen krever også tilstedeværelse av ekstracellulær Ca 2 + 12. Dette funnet reist spørsmålet om hvorvidt transmembrane pore fjerning fra celleoverflaten var også en rask prosess, som observert med mekaniske sår 5. Overraskende, våre nyere studier viste at resealing av celler permeabilized med poredannende giftstoffer har svært like egenskaper som reparasjon av mekaniske sår: prosessen krever ekstracellulære Ca 2 +, og er fullført innen ~ 30 sek. Gransker denne prosessen i mer detalj, vi har nylig lært at i tillegg til Ca 2 +-regulert eksocytose av lysosomer, innebærer plasma membran reparere en rask form for endocytose, som er utløst av utgivelsen av lysosomalenzymet syre sphingomyelinase (ASM) og er avgjørende ikke bare for the fjerning av transmembrane porene, men også for reparasjon av mekaniske sår 16. For å bestemme kinetikken av celle resealing etter permeabilization med poredannende proteiner, i vårt laboratorium vi tilpasset en direkte avbildning metodikk som hadde blitt brukt tidligere for å vurdere resealing av laser-skadet isolerte muskelfibre 17. Denne analysen er avhengig av egenskapene til den lipofile fargestoff FM1-43, som stabilt intercalates inn i den ytre paknings av lipid dobbeltlag øker i fluorescensintensiteten. Når plasma membranen bilayer blir forstyrret ekstracellulære fargestoff får tilgang til intracellulære membraner, som gir en følsom analyse for å påvise plasma membran skader og reparere 18,16,19,20. For å tilpasse denne assay for vurdering av cellen forsegles etter permeabilization med pore-dannende proteiner, vi pre-inkuberes cellene ved 4 ° C med den bakterielle toksin streptolysin O (SLO), som binder seg til membrankolesterol 21.. Synkron cellepermeabilization kan da lett oppnås ved å føre cellene fra isen for å varme medium i en oppvarmet objektbord, som aktiverer oligomerisering og forandring i konformasjon som fører til transmembrane poredannelse. En fordel med denne tilnærming, i de tidligere publiserte analyser ved hjelp av laser såret, er at et større antall celler kan bli analysert samtidig i en mikroskopisk felt, noe som gir bedre utvalg av cellepopulasjonen. Analysen vi beskriver her gitt mekanistiske likheter mellom cellen resealing prosessen sett etter mekanisk skade og permeabilization med poredannende giftstoffer, gir en meget allsidig og kraftig metode for å dissekere faktorer involvert i den grunnleggende prosessen med plasma membran reparasjon. Som et eksempel viser vi at det er mulig å bruke denne analysen å identifisere Ca 2 +-avhengige og uavhengige trinn av reparasjonsprosessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Plasma membranskade er en hyppig hendelse, og sårene har til å bli hurtig utbedres for å sikre celle overlevelse. Tilstrømningen av Ca 2 + er en viktig signal hendelse som utløser reparasjon av mekaniske skader på plasma membranen innenfor ~ 30 sek. Nyere studier viser at pattedyrceller også forsegle sine plasmamembran etter permeabilization med pore danner giftstoffer i en Ca 2 +-avhengig prosess som involverer eksocytose av lysosomalenzymet syre sphingomyelinase fulgt av pore endocytose. Her beskriver vi metodene som er brukt for å vise at den forsegles av celler permeabilized av toksinet streptolysin O er også rask og avhengig av Ca 2 + tilstrømningen. Analysen utforming tillater synkronisering av skaden arrangement og en presis måling av kinetiske evne til å gjenopprette celler plasmamembranintegritet etter avbildning og kvantifisere omfanget hvorved liphophilic fargestoff FM1-43 nådd intracellulære membraner. Denne live analyse also tillater en følsom vurdering av evnen til eksogent tilsatt løselige faktorer som sphingomyelinase å inhibere FM1-43 strøm, som gjenspeiler evnen til cellene å reparere deres plasma membran. Denne analysen tillater oss å vise for første gang at sphingomyelinase opptrer nedstrøms av Ca 2 +-avhengige exocytose, siden ekstracellulære tilsetning av enzymet fremmer forsegles av celler permeabilized i fravær av Ca 2 +.

Lave konsentrasjoner av bakteriell sphingomyelinase (SM) redning plasma membran reparasjon i celler utarmet i lysosomal syre sphingomyelinase. Ved hjelp av FM1-43 avbildning assay, vi tidligere viste at cellene som mangler for det lysosomale enzym ASM og utsatt for SLO såret i nærvær av Ca 2 + har en plasma membran defekt reddes av ekstracellulær tilsetning av det rekombinante humane enzym 19.. Siden den menneskelige lysosomal ASM har en lav pH-optimum, undersøkte vi ...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Sanntids avbildning av celler eksponert for den lipofile fargestoff FM1-43 tillater nøyaktig bestemmelse av kinetikken ved hvilken poredannende toksiner blir fjernet fra plasmamembranen. Dette er en følsom analyse som kan brukes til å vurdere krav Ca 2 +, sphingomyelinase og andre faktorer på plasmamembranen reparasjon.

Lev Imaging analysen for vurdering av roller av Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Og Sphingomyelinase i Reparasjon av poredannende Gift Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

En Eksplantasjon Assay for å vurdere Cellular Behavior av Cranial mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Leve Imaging av apoptotiske Cell Lagersalg under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenese

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Leve Cell Imaging av Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Tomat / GFP-FLP / FRT Metode for Live Imaging av Mosaic Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; fotoreseptorcellene

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vev fjerne metoden for tredimensjonale Imaging av fettvev

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...