Name: live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00
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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R37 AI34867 e R01 GM064625 a NWA Agradecemos ao Dr. R. Tweten da Universidade de Oklahoma para a expressão plasmídeo SLO.

1. Transcricional silenciamento de ASM <ol><li> Semente de 1,5 x 10 5 células HeLa em 2 ml de DMEM meio de crescimento (DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 1% de Penn-Strep) em pratos de fundo 35 milímetros de vidro (MatTek) e incubar durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2. </li><li> No dia seguinte, aspirado de fora os meios de crescimento e substituí-la com 2 ml de DMEM reduzida meio de soro (DMEM com 4% de FBS), pelo menos 1 h...

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

Estudos anteriores sobre o prejuízo e membrana plasmática reparo mecânico contou com diversos mecanismos de células ferindo, desde soltando pérolas de vidro, micropipetting, corte, arranhão ou raspagem. A leitura de todos estes ensaios foi qualitativa do que quantitativa, e não dar informações precisas sobre a cinética do mecanismo de reparo. A capacidade das células para voltar a selar a sua membrana de plasma após estas formas de lesão foi medida através da presença ou ausência de marcadores adicionado...

Ele tem sido conhecido há várias décadas que o reparo da membrana plasmática após a lesão mecânica é um 1,2 Ca 2 + processo-dependente. Estudos posteriores mostraram que o influxo de Ca2 + através da ferida provoca um processo de vigorosa de exocitose de vesículas intracelulares no local da lesão, que é necessária para selar 3,4. A taxa de perda de um corante fluorescente carregados para o citoplasma das células foi usada para avaliar a velocidade de reparação, e concluiu que resselagem foi completada dentro de &lt;30 seg após a lesão 5. Dois modelos foram inicialmente propostos para explicar a exigência de exocitose no reparo da membrana plasmática: 1) o modelo de &quot;patch&quot;, que sugeriu que influxo de Ca2 + através da lesão desencadeia fusão inicialmente homotipica de vesículas intracelulares, formando um grande &quot;patch&quot; que faria em seguida, ser aplicado para a membrana plasmática para selar a ferida 6 e 2) o modelo de redução de tensão, que propôs que a membrana added por Ca 2 + dependente de exocitose na vizinhança da ferida iria reduzir a tensão da membrana plasmática, o que facilita a nova selagem da bicamada 7. O papel do Ca 2 +-exocitose desencadeado no reparo da membrana plasmática foi reforçada por estudos que mostram que os lisossomos contêm uma molécula de Ca 2 + sensor, sinaptotagmina VII, o que facilita a sua exocitose e reparo da membrana plasmática das células lesadas 8,9,10,11 . No entanto, a evidência adicional indicou que exocitose por si só não foi suficiente para promover a reparação da membrana plasmática. Além lágrimas mecânicas na membrana do plasma, uma forma comum de lesão celular é a permeabilização de toxinas formadoras de poros produzidos por bactérias ou células imunitárias 12,13 14,15. Ao contrário de lágrimas mecânicos, proteínas formadoras de poros se inserir na membrana plasmática formando uma poro revestido a proteína estável, que não pode ser fechado de novo, simplesmente por aplicação de uma membrana de &quot;remendo&quot; ou por reduçãoção de tensão de membrana. Curiosamente, os estudos revelaram que as células de mamíferos têm um mecanismo eficaz para reparar a sua membrana de plasma após a permeabilização com proteínas formadoras de poros, e esse processo também requer a presença de extracelular de Ca 2 + 12. Esta descoberta levantou a questão de saber se a remoção transmembranar poros da superfície da célula, também é um processo rápido, tal como observado com feridas mecânicas 5. Surpreendentemente, os nossos estudos recentes mostraram que a nova selagem de células permeabilizadas com toxinas formadoras de poros tem propriedades muito semelhantes às da reparação de feridas mecânicas: o processo requer extracelular de Ca 2 +, e é completado dentro de ~ 30 segundos. Investigando esse processo com mais detalhes, que recentemente descobriu que, além de Ca 2 + exocitose regulada de lisossomos, reparo da membrana plasmática envolve uma forma rápida de endocitose, que é desencadeada pela liberação da enzima esfingomielinase ácida lisossomal (ASM) e é essencial não só para poe remoção dos poros transmembranares, mas também para a reparação de feridas mecânicos 16. Para determinar a cinética de relacração celular após permeabilização com proteínas formadoras de poros, em nosso laboratório, adaptado de uma metodologia de imagens ao vivo que tinha sido usado anteriormente para avaliar a nova selagem de fibras musculares isoladas ferido a laser 17. Este ensaio baseia-se nas propriedades do corante lipofílico FM1-43, que se intercala estavelmente no folheto exterior de bicamadas lipídicas aumento na intensidade de fluorescência. Quando a bicamada da membrana do plasma é interrompido ganhos corante extracelular acesso às membranas intracelulares, fornecendo um ensaio sensível para detecção de lesões da membrana plasmática e reparar 18,16,19,20. Para adaptar este ensaio para a avaliação de resselagem célula após permeabilização com proteínas formadoras de poros, se as células pré-incubadas a 4 ° C com a toxina bacteriana estreptolisina O (SLO), que se liga ao colesterol da membrana 21. Célula Synchronouspermeabilização pode, então, ser facilmente conseguido movendo as células de gelo para aquecer meio de uma fase de microscópio aquecida, a qual ativa a oligomerização e as alterações na conformação que leva à formação de poros transmembranares. Uma vantagem desta abordagem, ao longo dos ensaios publicados anteriormente usando o ferimento a laser, é de que um maior número de células podem ser analisadas simultaneamente num campo microscópico, proporcionando uma melhor amostragem da população de células. Dadas as semelhanças entre o processo de mecanicistas resselagem celular observada após a lesão mecânica e permeabilização com toxinas formadoras de poros, o ensaio aqui descrito proporciona um método muito versátil e eficiente para factores envolvidos no processo fundamental de reparação da membrana plasmática de dissecação. Como exemplo, mostra-se que é possível utilizar este ensaio para identificar os passos de Ca 2 + dependente e independente do processo de reparação.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Lesão da membrana plasmática é um evento freqüente e feridas têm de ser rapidamente reparado para garantir a sobrevivência celular. Influxo de Ca2 + é um evento chave de sinalização que desencadeia a reparação de feridas mecânicas na membrana de plasma no interior ~ 30 seg. Estudos recentes revelaram que as células de mamíferos também selar sua membrana plasmática após permeabilização com poros formando toxinas em um processo de 2 + dependentes de Ca que envolve a exocitose da esfingomielinase ácida enzima lisossomal seguido por poro endocitose. Aqui, nós descrevemos a metodologia utilizada para demonstrar que os fechos das células permeabilizadas pela toxina estreptolisina também é rápida e dependente de influxo de Ca2 +. O desenho do ensaio permite a sincronização do evento lesão e uma medição precisa da cinética da capacidade de células para restaurar a integridade da membrana plasmática por imagem e quantificar o grau pelo qual o corante liphophilic FM1-43 às membranas intracelulares. Este live als ensaioo permite uma avaliação da sensibilidade da capacidade de exogenamente adicionados factores solúveis, tais como a esf ingomielinase para inibir a FM1-43 afluxo, que reflecte a capacidade de células para reparar a sua membrana plasmática. Este ensaio permitiu demonstrar pela primeira vez que esfingomielinase actua a jusante de Ca 2 + dependente de exocitose, desde adição extracelular da enzima promove a re-selagem de células permeabilizadas, na ausência de Ca 2 +.

Baixas concentrações de reparo da membrana plasmática bacteriana esfingomielinase (SM) de resgate em células empobrecido em esfingomielinase ácida lisossomal. Usando o ensaio de imagiologia FM1-43, que mostraram previamente que as células deficientes para a enzima lisossomal ASM e expostas a SLO ferindo na presença de Ca2 + têm um defeito membrana plasmática é resgatado pela adição extracelular da enzima humana recombinante 19. Desde o ASM lisossomal humana tem...

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Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Imagens ao vivo de células expostas ao corante lipofílico FM1-43 permite a determinação precisa da cinética pelo qual as toxinas formadoras de poros são removidas a partir da membrana plasmática. Este é um ensaio sensível, que pode ser usado para avaliar os requisitos para Ca 2 +, esfingomielinase e outros factores de reparação da membrana plasmática.

Viva Imagem Ensaio para Avaliação das Funções de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; E esfingomielinase na reparação de Pore-formando feridas Tóxicas

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