Name: live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds
Uploaded: 2013-08-25T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R37 AI34867 och R01 GM064625 till NWA Vi tackar Dr R. Tweten från University of Oklahoma för SLO uttrycksplasmiden.

1. Transcriptional tysta av ASM <ol><li> Seed 1,5 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM-odlingsmedium (DMEM hög glukoshalt med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 1% Penn-Strep) på 35 mm glas botten rätter (MatTek) och inkubera över natten vid 37 ° C i en 5% CO2-inkubator. </li><li> Följande dag, aspirera utanför tillväxtmedier och ersätta den med 2 ml DMEM minskat serum-medium (DMEM med 4% FBS), minst 1 timme före tillsats av siRNA transfektion blandningen. </li><li> Förbered 4 r...

<ol>
	<li>Heilbrunn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The dynamics of living protoplasm. , (1956).</li><li>Chambers, R., Chambers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Explorations into the nature of the living cell. , (1961).</li><li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+resealing+by+a+vesicular+mechanism+similar+to+neurotransmitter+release.">Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release.</a> Science. 263, 390-393 (1994).</li><li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane.">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li><li>Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+facilitated+cell+membrane+resealing.">The mechanism of facilitated cell membrane resealing.</a> J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Chakrabarti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+membrane+resealing+and+autoimmune+myositis+in+synaptotagmin+VII-deficient+mice.">Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice.</a> J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).</li><li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O.">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li><li>Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+formation:+an+ancient+yet+complex+form+of+attack.">Pore formation: an ancient yet complex form of attack.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).</li><li>Morgan, B. P., Campbell, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recovery+of+human+polymorphonuclear+leucocytes+from+sublytic+complement+attack+is+mediated+by+changes+in+intracellular+free+calcium.">The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium.</a> Biochem. J. 231, 205-208 (1985).</li><li>Keefe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+triggers+a+plasma+membrane-repair+response+that+facilitates+CTL+induction+of+apoptosis.">Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis.</a> Immunity. 23, 249-262 (2005).</li><li>Idone, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+injured+plasma+membrane+by+rapid+Ca2+-dependent+endocytosis.">Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Tam, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exocytosis+of+acid+sphingomyelinase+by+wounded+cells+promotes+endocytosis+and+plasma+membrane+repair.">Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair.</a> J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).</li><li>Tweten, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol-dependent+cytolysins,+a+family+of+versatile+pore-forming+toxins.">Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins.</a> Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).</li><li>Zha, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingomyelinase+treatment+induces+ATP-independent+endocytosis.">Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis.</a> J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).</li><li>Buckley, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+three+membranes.+Channel+formation+by+aerolysin.">Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin.</a> FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).</li><li>Parker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Aeromonas+toxin+proaerolysin+in+its+water-soluble+and+membrane-channel+states.">Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states.</a> Nature. 367, 292-295 .</li><li>Yamaji-Hasegawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+and+pore+formation+of+a+sphingomyelin-specific+toxin,+lysenin.">Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin.</a> J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).</li></ol>

Tidigare studier på mekanisk skada och plasmamembran reparation förlitat sig på olika mekanismer för skadar celler, allt från att tappa glaspärlor, mikropipettering, klippning, repor eller skrapning. Avläsningen av alla dessa analyser var kvalitativ snarare än kvantitativ, och inte ge exakta uppgifter på kinetiken för mekanismen reparation. Förmågan hos celler att återförsluta deras plasmamembranet efter det att dessa former av skador mättes genom närvaro eller frånvaro av spårämnen tillsättas till d...

Det har varit känt under flera årtionden att plasmamembranet reparation efter mekanisk skada är en Ca 2 +-beroende process 1,2. Senare studier visade att Ca2 + inflöde genom såret utlöser en kraftfull process för exocytos av intracellulära vesiklar vid platsen för skadan, vilket krävs för återförslutning 3,4. Graden av förlust av ett fluorescerande färgämne laddas in i cytoplasman av celler användes för att bedöma hastigheten på reparation, och drog slutsatsen att återförslutning fördes inom &lt;30 sek efter skada 5. Två modeller ursprungligen föreslagits för att förklara kravet på exocytos i plasmamembranet reparation: 1) den &quot;patch&quot;-modellen, som föreslog att Ca2 + inflöde genom lesionen utlöser en början homotypisk fusion av intracellulära vesiklar, som utgör en stor &quot;patch&quot; som skulle sedan appliceras till plasmamembranet för att återförsluta såret 6 och 2) modell spänningen reduktion, där det föreslås att membranet added med Ca2 +-beroende exocytos i närheten av såret skulle reducera plasmamembranspänning, underlätta återförslutning av dubbelskiktet 7. Rollen av Ca2 +-utlöst exocytos i plasmamembranet reparation förstärktes ytterligare av studier som visar att lysosomer innehåller en Ca2 +-sensor molekyl, synaptotagmin VII, vilket underlättar exocytos och plasmamembran reparation i skadade celler 8,9,10,11 . Dock har ytterligare bevisning visade att enbart exocytos inte var tillräckliga för att främja plasmamembran reparation. Förutom mekaniska tårar på plasmamembranet, är permeabilisering av porbildande toxiner producerade av bakterier 12,13 eller immunceller 14,15 en frekvent form av cellskada. Till skillnad från mekaniska tårar, porbildande proteiner infoga sig på plasmamembranet som bildar en stabil, protein-fodrade por som inte kan återförslutas genom att helt enkelt applicera en membran &quot;patch&quot;, eller genom att minskaningsmembranspänning. Intriguingly studier visade att däggdjursceller har en effektiv mekanism för att reparera deras plasmamembran efter permeabilisering med por bildande proteiner, och denna process kräver också närvaron av extracellulärt Ca2 + 12. Detta fynd tog upp frågan om huruvida trans por bort från cellytan var också en snabb process, som observerats med mekaniska sår 5. Överraskande nog visade vår nya studier att återförslutning av celler permeabiliserade med por-bildande toxiner har mycket liknande egenskaper som reparation av mekaniska sår: processen kräver extracellulära Ca2 +, och slutförs inom ~ 30 sek. Undersökning av denna process i större detalj, som nyligen har vi lärt oss att förutom Ca 2 +-reglerad exocytos av lysosomer involverar plasmamembranet reparera en snabb form av endocytos, som triggas av frisättningen av det lysosomala enzymet surt sfingomyelinas (ASM) och är nödvändig inte bara för the avlägsnande av trans porer, men även för reparation av mekaniska sår 16. För att bestämma kinetiken hos cellåterförslutning efter permeabilisering med porbildande proteiner, i vårt laboratorium har vi anpassat en levande avbildning metod som hade använts tidigare för att bedöma återförslutning av laser skadade isolerade muskelfibrer 17. Denna analys bygger på egenskaper hos den lipofila färgämnet FM1-43, som stabilt interkalerar i den yttre broschyren av lipidbiskikt ökar i fluorescensintensiteten. När plasma membranbiskiktet störs cellulära färgämnes får tillgång till intracellulära membran, som ger en känslig analys för att detektera plasmamembranet skada och reparera 18,16,19,20. För att anpassa denna analys för bedömning av cell återförslutning efter permeabilisering med porbildande proteiner, vi förinkuberas cellerna vid 4 ° C med bakteriellt toxin streptolysin O (SLO), som binder till membran kolesterol 21. Synkron cellpermeabilisering kan sedan lätt uppnås genom att förflytta cellerna från isen att värma mediet i ett uppvärmt mikroskop skede, som aktiverar oligomerisering och förändring i konformationen som leder till transmembran porbildning. En fördel med denna metod, under de tidigare publicerade analyser med hjälp av laser såra, är att ett större antal celler kan analyseras samtidigt i ett mikroskopiskt område, vilket ger bättre provtagning av cellpopulationen. Med tanke på de mekanistiska likheterna mellan cellåterförslutningsprocessen ses efter mekanisk skada och permeabilisering med por-bildande toxiner, analysen beskriver vi här ger en mycket mångsidig och kraftfull metod för att dissekera faktorer som den grundläggande processen för plasmamembran reparation. Som ett exempel, visar vi att det är möjligt att använda denna analys för att identifiera Ca2 +-beroende och oberoende steg i reparationsprocessen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HeLa 229 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL2-1</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DMEM High Glucose No Calcium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>20168</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Optimem Reduced Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Control medium GC content RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12935300</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMPD1 RNAi oligo</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>HSS143988</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat-inactivated</td>
			<td>Gemini-Bioproducts</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sphingomyelinase from Bacillus cereus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7651</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>35 mm-glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-14</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>C9100-50</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spinning disk confocal microscope</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>UltraViewVoX</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Software analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Volocity Suite</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Environmental chamber</td>
			<td>Pathology Devices</td>
			<td>LiveCell System Chamber</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

live imaging assay for assessing the roles of ca2+ and sphingomyelinase in the repair of pore-forming toxin wounds

Plasma membranskada är en vanlig händelse, och sår måste snabbt repareras för att säkerställa cellöverlevnad. Flödet av Ca 2 + är en viktig signalerande händelse som utlöser reparation av mekaniska skador på plasmamembranet inom ~ 30 sek. Nyligen genomförda studier visar att däggdjursceller återför även deras plasmamembran efter permeabilisering med por bildar toxiner i en 2 +-beroende process Ca som involverar exocytos av det lysosomala enzymet surt sfingomyelinas följt av por endocytos. Här beskriver vi den metod som används för att visa att den återförslutning av celler permeabilized av toxinet streptolysin O är också snabb och beroende av Ca2 + inflöde. Analysen design tillåter synkronisering av händelsen skada och en noggrann kinetisk mätning av förmågan hos celler att återställa plasmamembranintegritet, genom att avbilda och kvantifiera den utsträckning varmed lipofil färgämnet FM1-43 når intracellulära membran. Denna levande analys also medger en känslig bedömning av förmågan hos exogent tillsatt lösliga faktorer såsom sfingomyelinas att inhibera FM1-43 tillströmning, vilket återspeglar förmågan hos celler att reparera sitt plasmamembran. Denna analys tillät oss att visa för första gången att sfingomyelinas verkar nedströms av Ca 2 +-beroende exocytos, eftersom extracellulärt tillsats av enzymet främjar återförslutning av celler permeabiliserade i frånvaro av Ca2 +.

Låga halter av bakterie sfingomyelinas (SM) räddningsplasmamembran reparation i celler utarmat på lysosomala syra sfingomyelinas. Använda FM1-43 avbildningsanalys, tidigare har vi visat att celler med brist på det lysosomala enzymet ASM och utsatta för SLO sårskada, i närvaro av Ca 2 + har en plasmamembrandefekt räddas av extracellulära tillsatsen av det rekombinanta humana enzymet 19. Eftersom humant lysosomalt ASM har ett lågt pH-optimum, undersökte vi om åt...

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds at JoVE.com

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live avbildning av celler som utsätts för den lipofila färgämnet FM1-43 möjliggör exakt bestämning av kinetiken genom vilken por-bildande toxiner avlägsnas från plasmamembranet. Detta är en känslig analys som kan användas för att bedöma kraven för Ca2 +, sfingomyelinas och andra faktorer på plasmamembran reparation.

Live Imaging analys för bedömning av roller Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Och sfingomyelinas i Reparation av por-bildande Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

Live avbildning av Zebrafish embryonal hjärna av konfokalmikroskopi

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

In vivo Ca 2 + - avbildning av Svamp Body nervceller under Olfactory lära i Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Tekniker för Imaging Ca 2 + Signalering i mänskliga spermier

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

Electron Spin Resonance Micro-avbildning av Live Arter för Oxygen Mapping

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Levande cell Kalcium Imaging Kombinerat med siRNA Medierad geners uttryck Identifierar Ca 2 + Läckage kanaler i ER membranet och deras regleringsmekanismer

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

Ett explantat analys för bedömning Cellular Beteende för Kranial mesenkym

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Live avbildning av Apoptotic Cell Utförsäljning under<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenesis

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Levande cell imaging av Early autophagy Evenemang: Omegasomes och Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Den Tomat / GFP-FLP / FRT Metod för Live avbildning av Mosaic vuxen<em&gt; Drosophila</em&gt; ljusmätare celler

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: En vävnad Clearing metod för tredimensionell avbildning av fettvävnad

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...