Name: multi-scale modification of metallic implants with pore gradients, polyelectrolytes and their indirect monitoring in vivo
Uploaded: 2013-07-01T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Dr. Andre Walder y Nicolas Perrin para la fabricación de implantes de titanio, K. Benmlih para la acumulación de los moldes de teflón y el Dr. G. Prevost por su ayuda con los experimentos con animales. También reconocemos la región de Alsacia y PMNA (Pole Materiaux et Nanociencias d&#39;Alsace) para la contribución financiera.

1. Preparación de gradientes microporos en implantes metálicos macroporosas <ol><li> Limpiar los implantes (tales como implantes hechos de perlas de titanio de grado médico con un rango de tamaño de micras 400-500, Neyco SAS, Francia) con etanol y luego someter a ultrasonidos en acetona durante 15 min. </li><li> Diseño y fabricación de moldes de Teflón de acuerdo con el tamaño del implante y la forma (Para los experimentos estándar, se utilizan moldes cilíndricos de 1,5 cm de diámetro con una altura de 2 cm...

<ol>
	<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering.">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 4, 518-524 (2005).</li><li>Ryan, G., Pandit, A., Apatsidis, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+poly(L-lactide)+(PLLA)+scaffolds+for+tissue+engineering+using+liquid+-+liquid+phase+separation+and+freeze+extraction.">Fabrication of porous poly(L-lactide) (PLLA) scaffolds for tissue engineering using liquid - liquid phase separation and freeze extraction.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, 105-111 (2009).</li><li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+macroporous+titanium+tracheal+implants+with+biodegradable+structures:+Tracking+in+vivo+integration+for+determination+of+optimal+in+situ+epithelialization+conditions.">Modification of macroporous titanium tracheal implants with biodegradable structures: Tracking in vivo integration for determination of optimal in situ epithelialization conditions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109, 2134-2146 (2012).</li><li>Dupret-Bories, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+protocol+for+implantation+of+tracheal+prostheses+in+sheep.">Development of surgical protocol for implantation of tracheal prostheses in sheep.</a> J. Rehabil. Res. Dev. 48, 851-864 (2011).</li><li>Gasnier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+location+of+post-translational+modifications+on+chromogranin+B+from+bovine+adrenal+medullary+chromaffin+granules.">Characterization and location of post-translational modifications on chromogranin B from bovine adrenal medullary chromaffin granules.</a> Proteomics. 4, 1789-1801 (2004).</li><li>Vrana, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Titanium/Biodegradable+Polymer+Implants+with+an+Hierarchical+Pore+Structure+as+a+Means+to+Control+Selective+Cell+Movement.">Hybrid Titanium/Biodegradable Polymer Implants with an Hierarchical Pore Structure as a Means to Control Selective Cell Movement.</a> PLoS ONE. 6, e20480 (2011).</li><li>Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Fibrin+Gel+Bead+Assay+for+the+Study+of+Angiogenesis.">Optimized Fibrin Gel Bead Assay for the Study of Angiogenesis.</a> J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).</li><li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Human+Umbilical+Vein+Endothelial+Cells+and+Their+Use+in+the+Study+of+Neutrophil+Transmigration+Under+Flow+Conditions.">Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions.</a> J. Vis. Exp. (66), e4032 (2012).</li><li>Dong, C. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomediated+crosslinking+of+C6-cinnamate+derivatized+type+I+collagen.">Photomediated crosslinking of C6-cinnamate derivatized type I collagen.</a> Biomaterials. 26, 4041-4049 (2005).</li></ol>

Gradientes de poro son herramientas importantes en la ingeniería de tejidos interfaz y el sistema descrito aquí se pueden usar solos o en combinación con implantes metálicos para formar gradiente de poro para estudiar la migración celular. El sistema no requiere ninguna configuración adicional o equipo adicional, excepto una campana de extracción química para manejar disolventes orgánicos, por lo tanto, se puede aplicar en los laboratorios de biología. Polímeros similares, tales como poli (ácido glicólico) ...

Actualmente los implantes metálicos disponibles son adecuados para aplicaciones de carga, pero su no degradabilidad requiere diseños que garantizan una fuerte interfase con el tejido que rodea 1. Al proporcionar estructuras que facilitan el crecimiento celular y la colonización in vivo, la vida útil de los implantes metálicos se puede prolongar 2. Implantes metálicos porosos están abiertamente materiales para la ingeniería de interfaz de tejido prometedores y también para garantizar una buena colonización de los implantes. Se han utilizado activamente como implantes ortopédicos y también como implantes traqueales 3-5. Sin embargo, todavía hay problemas que necesitan ser resueltos, tales como el control preciso sobre el movimiento de las células en las zonas de poro. Falta de control de este proceso podría dar lugar a la colonización incompleta en un extremo y la restenosis en el otro. También es necesario para la consecución de funciones superiores como, la entrega de factores de crecimiento funcionalización adicional de estos implantes,vascularización dirigida y el movimiento simultáneo de diferentes tipos de células 6-8. Para los implantes traqueales, esto es crucial, ya que es deseable la colonización del implante por un tejido vascularizado. Sin embargo, el tejido no controlada en el crecimiento a la luz de la tráquea no es deseable debido a que disminuye la permeabilidad del implante. Una posibilidad para controlar el movimiento de la célula es de exclusión de tamaño. Al conocer el tamaño de las células diana y su capacidad para interactuar con un polímero sintético dado es posible desarrollar gradientes de poros que pueden determinar eficazmente la profundidad de movimiento de la célula. Por ejemplo mediante la creación de una arquitectura de poro que es lo suficientemente grande para la entrada de las células del tejido conectivo tales como los fibroblastos extraluminal, pero lo suficientemente pequeñas (menos de 10 micras) para evitar su movimiento intraluminal un control efectivo sobre la colonización de un implante tubular se puede lograr. De los métodos de creación de poros disponibles, tales como congelación drying, la lixiviación de partículas, gas espumante 9,10, y el método más fácil de adaptar para la rápida formación de gradientes de poro con mínima cantidad de equipos necesarios se congela y extracción 11. En este método, una solución de polímero se congela en una mezcla binaria de un disolvente orgánico y agua. Después, el disolvente se intercambia a través de la extracción por un líquido pre-enfriado miscible, tal como etanol. Congelación y condiciones de extracción determinan la forma y el tamaño de los poros y si la extracción se lleva a cabo de una manera donde el movimiento de la solución de extracción puede ser controlado, el tamaño y forma de los poros pueden ser direccionalmente modulada. Segundo paso para los tejidos multicelulares es la formación de barreras porosas entre diferentes tipos de células para el control de su interacción. Esto también es necesario para la disponibilidad de los distintos microambientes para diferentes tipos de células en función de sus requisitos de 12,13. Tráquea es un órgano tubular que conecta la laringe con bronquioloi. Tiene un revestimiento de epitelio pseudoestratificado ciliar interior con células caliciformes interdispersados ​​que producen moco. La estructura 3D y la estabilidad de la tráquea se mantiene por el cartílago en forma de C-anillos. Por lo tanto, en una tráquea artificial no debe haber una unión definida entre el tejido conectivo y la capa del epitelio ciliar. Si bien una estructura 3D es necesario para la parte del tejido conectivo, la migración de las células epiteliales requiere una membrana-como sótano superficie para lograr el movimiento direccional y el cierre de la herida. Películas multicapa polielectrolito (PEM) son una opción posible obtener imita la membrana basal. Método de capa por capa (LBL) es un proceso versátil para obtener recubrimientos superficiales delgadas y funcional. Se basa en las interacciones electrostáticas de dos polielectrolitos de carga opuesta y su acumulado en forma secuencial para obtener recubrimientos de superficies a escala nanométrica, cuyas propiedades se pueden variar cambiando simplemente las variables tales como las especies de polielectrolitos, pH,número de la capa, la adición de una capa de cobertura, la reticulación etc Una de las principales ventajas del método LbL es su capacidad para adaptarse a la topografía del sustrato subyacente. Por lo tanto, en condiciones controladas, este método también se puede utilizar para la obtención de cobertura de la superficie de las estructuras porosas. Si colágeno se utiliza como uno de los polielectrolitos es posible obtener estructuras nanofibrillar que pueden imitar la superficie de la membrana basal. La hidrofobicidad de titanio permite el desarrollo de tales estructuras y fibrillarity puede ser preservada en revestimientos gruesos 14. Archivo adjunto y el movimiento de células en la superficie también se puede controlar esta manera. Mediante el uso de congelación-extracción y recubrimiento de película LbL secuencialmente, una estructura en la que el movimiento de células puede ser controlado lateralmente, longitudinalmente y circunferencialmente se puede obtener 15. Aquí se describen dos métodos de modificación novedosos para los implantes de titanio mediante el uso de su comportamiento hidrófobo que puede serextendido a la modificación de diversos implantes porosos: i) formación de gradientes de microporos dentro de los implantes de titanio con macroporosas hidrófobos, polímeros sintéticos ii) la formación de una capa de película polimérica de espesor sobre la superficie del implante que soporta el crecimiento celular y la formación de revestimiento en multicapas de polielectrolitos. Estos métodos se pueden utilizar secuencialmente o por separado. Ellos proporcionan estructuras que aseguran la migración controlada y la organización espacial de los diferentes tipos de células en los tejidos multicelulares 16,17. Para el caso específico de la tráquea, el resultado deseado para el implante sería la colonización por el tejido fibrovascular dentro de los gradientes de microporos sin reestenosis y la formación del revestimiento interior de las células epiteliales ciliadas en las multicapas de polielectrolitos. Una forma de controlar la integración de los implantes es hacer pequeñas intervenciones quirúrgicas durante el período de su integración con el host in situ. Con el fin de ser capaz de t• Decidir sobre el momento de las intervenciones, es importante disponer de información sobre los efectos sistémicos de los implantes. Proteína C reactiva (PCR) se ha utilizado para el seguimiento de la infección y la respuesta inflamatoria en el ámbito clínico. Cromogranina A (CGA) también se puede utilizar de una manera similar y podría proporcionar resultados más precisos para observar el nivel de inflamación 18. Como una posible forma de observar la integración del implante metálico in vivo, se presenta un procedimiento de vigilancia continua de los efectos sistémicos de implante por la caracterización de las muestras de sangre de animales con Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) y la secuenciación de proteínas posterior. Elaboración de este método se puede utilizar para evadir el análisis histológico de punto final normal. Corte histológico de los implantes metálicos es un proceso largo, complicado y costoso y sólo puede ser realizada en puntos de tiempo específicos. Debido a esta razón, bien diseñado pruebas de sangre que proporcionan información sólida acerca de la salud del implante secomo posibles vías para reducir los experimentos con animales a lo dispuesto por las recientes normas de la UE relativas a los experimentos con animales. Los métodos presentados aquí pueden ser utilizados para mejorar el rendimiento de los implantes metálicos a través de funcionalización o tener una forma alternativa de seguimiento de los implantes existentes.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagent</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dioxane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>360481</td>
 <td>Toxic material, Strictly under chemical hood</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLLA 
 i. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~0.5 dl/g 
 ii. Poly(L-lactide) inherent viscosity ~2.0 dl/g 
 </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>94829, 81273</td>
 <td>The choice of molecular weight and inherent viscosity is application dependent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PRONOVA UP LVG (Sodium Alginate)</td>
 <td>Novamatrix</td>
 <td>4200006</td>
 <td>Low viscosity(20-200 mPa.s)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagen type I (Bovine)</td>
 <td>Symatese</td>
 <td>CBPE2US100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pen/Strep, Fungizone </td>
 <td>Promocell</td>
 <td>C42020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Genipin</td>
 <td>Wako</td>
 <td>0703021</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon nitride probes with aspring constant of 0.03 N.m-1. </td>
 <td>Bruker </td>
 <td>MSCT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trifluoroacetic acid for HPLC ,&ge;99.0% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>302031</td>
 <td>Hazardous Material, Please follow MSDS carefully</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetonitrile, for HPLC ,&ge;99.9% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34998</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calcein-AM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>C3100MP </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>PKH26GL</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rabbit C-Reactive Protein (CRP) ELISA kit</td>
 <td>Genway Bio</td>
 <td>GWB-9BF960 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO, Bioreagent, &ge;99.7% </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D2650</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Nanoscope IV Atomic Force microscope</td>
 <td>Bruker</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Procise microsequencer </td>
 <td>Applied Biosystems </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ultima 3000 HPLC system </td>
 <td>Dionex</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Scanning Electron Microscope Hitachi TM 100</td>
 <td>Hitachi </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal Scanning Laser Microscope Zeiss LSM 510 </td>
 <td>Zeiss </td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
Table 1. List of Materials and Reagents.

multi-scale modification of metallic implants with pore gradients, polyelectrolytes and their indirect monitoring in vivo

Los implantes metálicos, especialmente los implantes de titanio, son ampliamente utilizados en aplicaciones clínicas. El crecimiento del tejido y la integración de estos implantes en los tejidos son parámetros importantes para los resultados clínicos de éxito. Con el fin de mejorar la integración del tejido, los implantes metálicos porosos han de ser desarrollado. La porosidad abierta de espumas metálicas es muy ventajoso, ya que las zonas de poro se pueden funcionalizar sin comprometer las propiedades mecánicas de toda la estructura. A continuación se describen las modificaciones que utilizan implantes de titanio porosos basados ​​en microesferas de titanio. Mediante el uso de propiedades físicas inherentes, tales como hidrofobicidad de titanio, es posible obtener gradientes de poro hidrófobas dentro de los implantes metálicos basados ​​en microesferas y al mismo tiempo tener un mimético de membrana basal basa en hidrófilos, polímeros naturales. Gradientes de poro 3D están formados por polímeros sintéticos tales como ácido poli-L-láctico (PLLA) por el método de congelación-extracción. 2D nanofibrillar surcaras se forman mediante el uso de colágeno / alginato seguido de una etapa de reticulación con un agente de reticulación naturales (genipín). Esta película nanofibrillar fue construido por capa por capa (LBL) método de deposición de las dos moléculas de carga opuesta, colágeno y alginato. Por último, un implante, donde diferentes zonas pueden acomodar diferentes tipos de células, ya que esto es necesario para muchos tejidos multicelulares, se puede obtener. Por, de esta manera el movimiento celular en diferentes direcciones por diferentes tipos de células puede ser controlada. Tal sistema se describe para el caso específico de la tráquea regeneración, pero puede ser modificada para otros órganos diana. Análisis de la migración celular y los métodos posibles para la creación de diferentes gradientes de poro se elaboran. El siguiente paso en el análisis de dichos implantes es su caracterización después de la implantación. Sin embargo, el análisis histológico de los implantes metálicos es un proceso largo y engorroso, por lo tanto para la supervisión reacción del huésped a los implantes metálicos in vivo una unlternative método basado en el seguimiento de las proteínas sanguíneas CGA y diferente también se describe. Estos métodos se pueden utilizar para el desarrollo in vitro de la migración a medida y las pruebas de colonización y también se pueden utilizar para el análisis de los implantes metálicos funcionalizados in vivo sin histología.

La formación de gradientes de poro Mediante el cambio de la concentración de la solución de PLLA, es posible controlar el tamaño de los poros en el lado extraluminal de los implantes. Tamaño y forma de los poros se vio afectada significativamente por la presencia de los implantes de titanio (Figuras 1a y 1b). Tamaños de los poros oscilaron desde 40 hasta 100 micras y la utilización de concentraciones más bajas resultaron en poros más pequeños. Conside...

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Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

En este video, vamos a demostrar las técnicas de modificación de los implantes metálicos porosos para mejorar su funcionalidad y para controlar la migración celular. Las técnicas incluyen el desarrollo de los gradientes de poros para controlar el movimiento celular en 3D y la producción de la membrana basal imita para controlar el movimiento de células en 2-D. Además, un método basado en HPLC para seguimiento de la integración del implante in vivo a través de análisis de proteínas de la sangre se describe.

Modificación Multi-Escala de implantes metálicos con gradientes de poro, polielectrolitos y su control indirecto<em&gt; En vivo</em

Metallic implants, especially titanium implants, are widely used in  clinical applications. Tissue in-growth and integration to these implants in  the ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Multi-Scale Modification of Metallic Implants With Pore Gradients, Polyelectrolytes and Their Indirect Monitoring In vivo

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Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Técnica quirúrgica para la implantación de la ingeniería tisular injertos vasculares y posterior<em&gt; En Vivo</em&gt; Monitoreo

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

Generation of Scalable, Metallic High-Aspect Ratio Nanocomposites in a Biological Liquid Medium

Generación de Scalable, metálico de alta Aspect Ratio nanocompuestos en una Biológica Medio Líquido

The goal of this protocol is to describe the synthesis of two novel biocomposites with high-aspect ratio structures. The biocomposites consist of copper ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Síntesis de nanofibras a base de Queratina de Ingeniería Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate PolyLactic Acid Scaffolds with Graded Pore Size

Un Facile y respetuoso del medio ambiente de ruta para la fabricación de poli (ácido láctico) Los andamios con graduado Tamaño de poro

Over the recent years, functionally graded scaffolds (FGS) gaineda crucial role for manufacturing of devices for tissue engineering. The importance of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

Síntesis de nanotubos de carbono multipared modificados con nanopartículas de plata y la evaluación de sus actividades antibacterianas y propiedades citotóxicas

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...