Name: metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures at JoVE.com

PROCEDURE الكواشف ومخازن الشائعة المستخدمة في بروتوكول استخراج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مختبر الدفع النفاث المتوسطة للنبات الأرابيدوبسيس thaliana الثقافات الخلية تعليق <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-alig...

<ol>
	<li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport,+signal+transduction+and+membrane+trafficking.">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li><li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface.">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li><li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells.">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li><li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment.">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+rafts+in+cell+membranes.">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li><li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains:+insights+from+model+membrane+studies.">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li><li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+and+animal+cells,+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts.">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li><li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location.">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li><li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-&#223;-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics.">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-&#223;-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li><li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling,+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins.">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li><li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity.">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li><li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco.">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li><li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation.">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li><li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li><li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco.">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li><li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites.">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li><li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants.">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation.">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li><li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry.">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li><li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID,+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos.">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li><li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StatQuant:+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry.">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li><li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+wants+cRacker:+Automated+standardized+data+analysis+of+LC/MS+derived+proteomic+data.">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li><li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+of+remorins,+a+plant-specific+protein+family:+Evolutionary+and+functional+perspectives.">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li><li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondetergent+isolation+of+rafts.">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li><li>Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method.">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li><li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts.">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li><li>M&#252;hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).</li><li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li><li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors.">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li><li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics.">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li><li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins.">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li></ol>

بروتوكول المعروضة في هذه الورقة تحتوي على العديد من الخطوات وجميعهم من الأهمية بمكان الحصول على تجزئة نقية وممثل للغشاء البلازما النباتية في أغشية مقاومة المنظفات والمنظفات كسور قابلة للذوبان. وبالتالي، فمن المهم أن تتبع كل خطوة وفقا للتعليمات. <p class="jove_content" style=";...

في عام 1972، اقترح جوناثان سينغر ونيكلسون نموذج غارث فسيفساء السائل نموذج هيكل الأغشية الخلوية، ليحل محل النموذج ساندويتش البروتين الدهني البروتين الذي تم المقبولة عموما في أوائل 1960s. المغني ونيكلسون افترض أن غشاء بيولوجي يمكن اعتباره السائل ثنائي الأبعاد حيث نشر كل الدهون والبروتينات جزيئات بحرية وبسهولة 5. منذ ذلك الوقت، نموذج هيكل غشاء البلازما والمعرفة لتكوين غشاء أصبح أكثر تعقيدا. بشكل خاص، داخل غشاء البلازما، والهياكل مثل المجمعات البروتين والدهون / ستيرول مقرها microdomains المختلين هيكليا يمكن ملاحظتها. في الأغشية النموذج الصناعي 6،7، يمكن الجامدة والدهون الإسفنجية فصل أفقيا من الأنواع الدهون الأخرى لتشكيل الأقاليم مع ميزات المادية المتغيرة. ويتسبب هذا الفصل أساسا داخل الغشاء الخلوي من خصائص الربط الذاتي بين الجامدة وسا غايةالسلاسل الهيدروكربونية turated من phopsho والدهون الإسفنجية 8. بشكل خاص، يرن ستيرول جامدة تفضل التفاعل مع صلابة والأنواع الدهون المشبعة واستقامة هذه التفاعلات إجبار السلاسل الهيدروكربونية المجاورة إلى أكثر التشكل الموسعة، زيادة سمك الغشاء وصلابة. كان واحدا من السمات يلاحظ عموما من ستيرول التخصيب microdomains غشاء الصلابة سفرهم عند العلاج مع المنظفات غير الأيونية مثل هذا تريتون X-100 أو بريج 35. ويعتقد أن هذه الكسور لتكون متطابقة مع microdomains الغشاء وكانت تسمى أغشية مقاومة المنظفات (DRM) على أساس على طريقة إعداد البيوكيميائية 2. استخدام المنظفات غير أيوني خلال استخراج DRM تلقى بعض الانتقادات مثل إعداد DRM البيوكيميائية قد لا تتوافق مباشرة إلى أي مقصورة غشاء محددة داخل الخلية الحية 9. وخاصة، والمنظفات لنسبة البروتين يبدو حاسما في مثل هذه الاستعدادات، ويمكن ق المنظفات المختلفة، فضلا عن كميات المنظفات المختلفة تسفر عن تكوين مختلفة من المنظفات مقاومة الغشاء جزء 10. ومع ذلك، هناك أدلة على أن الأنواع بروتين معين المنتسبين على وجه التحديد مع هذه المجالات غشاء ستيرول الغنية الخلوية، والتي يتم إثراء هذه البروتينات جيدا في التحضيرات الكيميائية الحيوية المقاومة للكسور الغشاء المنظفات 11. كان جوهر البروتينات التي تم العثور عليها في المصنع DRM كسر، والتي كان وجودها في DRMS ​​ستيرول تعتمد، ولا سيما البروتينات GPI الراسية، مثل البروتينات مثل fasciclin arabinogalactan (إف إل أي إس) وأفراد من عائلة البروتين SKU. كما يشير بعض البروتينات، مثل تحركات مثل مستقبلات أو phospholipases تم العثور على 11. هذه النتائج متسقة مع العديد من الدراسات على البروتين microdomains غشاء الثدييات 12،13. أيضا في النباتات هناك أدلة متزايدة لدور microdomains الغشاء في سياق الاستجابة للضغط النفسي 14 -16. بروتوكول الموصوفة هنا يوفر طريقة قوية للتجزئة من microdomains غشاء البلازما، ويستخدم بشكل خاص على البروتين لتركيز المنظفات التي تسمح لنا لتصوير الاجهاد الناجم التعديلات للستيرول الغنية غشاء مقصورة 4،11،14.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia (stock 25 % solution)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>010-03166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 10 &mu;m</td>
			<td>GL-Science</td>
			<td>5020-75010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol(PEG 3350)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>88276</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran T500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K15NO3</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-765-PK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac RVC 2-25</td>
			<td>Christ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures

البلازما microdomains غشاء هي الميزات على أساس الخصائص الفيزيائية للدهون وستيرول البيئة ولها أدوار معينة في عمليات الإشارة. استخراج microdomains غشاء التخصيب ستيرول من الخلايا النباتية لتحليل البروتين هو مهمة صعبة ويرجع ذلك أساسا إلى إعداد خطوات متعددة ومصادر التلوث للمن المقصورات الخلوية الأخرى. يشكل غشاء البلازما فقط حوالي 5-20٪ من جميع الأغشية في الخلايا النباتية، وبالتالي عزل عالي النقاء جزء غشاء البلازما يمثل تحديا. ويتضمن الطريقة المستخدمة في كثير من الأحيان مائي التقسيم على مرحلتين في غليكول البولي ايثيلين وديكستران والتي ينتج عنها حويصلات غشاء البلازما بدرجة نقاء 95٪ 1. microdomains غشاء ستيرول الغنية داخل غشاء البلازما هي غير قابلة للذوبان على العلاج مع المنظفات غير أيوني الباردة في درجة الحموضة القلوية. يمكن فصل هذا الكسر غشاء مقاومة للالمنظفات من غشاء البلازما بالجملة من قبل تنبيذ فائق في النحوالتدرج ucrose 2. في وقت لاحق، والبروتينات يمكن استخلاصها من الموجات المنخفضة الكثافة من التدرج السكروز بواسطة الميثانول / كلوروفورم هطول الأمطار. وبعد ذلك يتم هضمها التربسين البروتين المستخرج، المحلاة وتحليلها أخيرا LC-MS/MS. هو الأمثل لدينا بروتوكول استخراج لmicrodomains-ستيرول الغنية لإعداد نظيفة مقاومة للالمنظفات الكسور غشاء الخلية من ثقافات نبات الأرابيدوبسيس thaliana. نستخدم وضع العلامات الأيضية الكامل للنبات الأرابيدوبسيس thaliana الثقافات الخلية التعليق مع K 15 NO 3 كمصدر للنيتروجين فقط للدراسات المقارنة البروتين الكمي التالية المعالجة البيولوجية من الفائدة 3. عن طريق خلط نسب متساوية من الثقافات خلية وصفت وغير المسماة لاستخراج البروتين مشتركة يتم الاحتفاظ تأثير على خطوات إعداد النتيجة النهائية الكمية كحد أدنى. أيضا خسائر ماديه اثناء الاستخراج سوف تؤثر على كل من الرقابة وعينات المعاملة في نفس الطريق، ووبالتالي د نسبة الضوء ويتنفس الببتيد سوف تظل ثابتة. في الطريقة المقترحة إما المسمى أو زراعة الخلايا غير المسماة تخضع لعملية المعالجة البيولوجية، في حين أن الآخر بمثابة السيطرة 4.

مع بروتوكول المعروضة باستخدام المسمى أيضي الثقافات خلية نبات الأرابيدوبسيس فمن الممكن لعزل أغشية البلازما من الأنسجة النباتية (STEP2، أرقام 2 و 4)، وإثراء لمقاومة المنظفات الكسور الغشاء داخل غشاء البلازما (الخطوة 3 أرقام 3 و 5). في وقت لاحق، ويسمح ا...

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures at JoVE.com

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

نحن هنا تصف طريقة قوية للتجزئة أغشية البلازما مصنع المنظفات في الأغشية القابلة للذوبان مقاومة والمنظفات يعتمد على خليط من غير المسماة في الجسم الحي بالكامل و15 N المسمى الثقافات خلية نبات الأرابيدوبسيس thaliana. يتم تطبيق هذا الإجراء للدراسات المقارنة البروتين لفهم العمليات الإشارة.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

التعريفي واستخراج السم من البروتين فيوزاريوم النيابة. الثقافات للدراسات البروتين

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

الأزهار وتراجع تحويل thaliana Arabidopsis لتفحص pTSO2 : β غلوكورونيداز التعبير مراسل جين

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

الأيضية وصفها من لوسين ريتش كرر تحركات 1 و 2 مع المشعة الفوسفات

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

نهج جديد لتحليل مقارن لMultiprotein مجمعات بناء على<sup&gt; 15</sup&gt; N الأيض وصفها والكمية الطيف الكتلي

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

تلطيخ النسيجية من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الخليوي الثانوية ستريت عناصر

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

تحليل الوقت الحقيقي ايض الملف في<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافات ماوس المعوية سرداب عضي

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

الثقافات الابتدائية المختلطة الفئران الأمعاء الدقيقة المعدة للدراسة غوت هرمون إفراز ولايف التصوير خلية من خلايا Enteroendocrine

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

تحليل "سلوك نمو" نبات التمويل في "نوعيات مختلفة من الضوء"

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells (Video) | JoVE 

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...