Name: metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures
Uploaded: 2013-09-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures at JoVE.com

절차 추출 프로토콜에서 사용되는 일반적인 시약 및 버퍼 : <ol><li> 애기 장대 서스펜션 세포 배양에 대한 JPL 매체 <ul><li> 3 μM의 H 3 BO 3 </li><li> 3 μM MnSO 4 개의 x H 2 O </li><li> 1.1 μM ZnSO 4 × 7 H 2 O </li><li> 0.15 μM의 KJ </li><li> 0.03 μM 나 2 무 4 × 2 H 2 O </li><li> 3 nm의의 CoCl2 x 6 H 2 O </li><li> ...

<ol>
	<li>Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+plasma+membrane+proteomics+identifies+components+of+transport,+signal+transduction+and+membrane+trafficking.">Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking.</a> Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).</li><li>Brown, D. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+of+GPI-anchored+proteins+to+glycolipid-enriched+membrane+subdomains+during+transport+to+the+apical+cell+surface.">Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface.</a> Cell. 68, 533-544 (1992).</li><li>Lanquar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=15N-metabolic+labeling+for+comparative+plasma+membrane+proteomics+in+Arabidopsis+cells.">15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells.</a> Proteomics. 7, 750-754 (2007).</li><li>Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ratio-dependent+significance+thresholds+in+reciprocal+15N-labeling+experiments+as+a+robust+tool+in+detection+candidate+proteins+responding+to+biological+treatment.">Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment.</a> Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).</li><li>Singer, S. J., Nicolson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluid+mosaic+model+of+the+structure+of+cell+membranes.">The fluid mosaic model of the structure of cell membranes.</a> Science. 175, 720-731 (1972).</li><li>Simons, K., Ikonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+rafts+in+cell+membranes.">Functional rafts in cell membranes.</a> Nature. 387, 569-5672 (1997).</li><li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+fluid/fluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles.">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).</li><li>Silvius, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+of+membrane+molecules+between+raft-and+non+raft-domains:+insights+from+model+membrane+studies.">Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).</li><li>Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+plant+and+animal+cells,+detergent-resistant+membranes+do+not+define+functional+membrane+rafts.">In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts.</a> Plant Cell. , (2011).</li><li>Lauwers, E., Andre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+yeast+transporters+with+detergent-resistant+membranes+correlates+with+their+cell-surface+location.">Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location.</a> Traffic. 7, 1-15 (2006).</li><li>Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+Arabidopsis+sterol-rich+membrane+microdomains+by+differential+treatment+with+methyl-&#223;-cyclodextrin+and+quantitative+proteomics.">Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-&#223;-cyclodextrin and quantitative proteomics.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).</li><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+signal+transduction.">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).</li><li>Maeda, Y., Kinoshita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+remodeling,+trafficking+and+functions+of+glycosylphosphatidylinositol-anchored+proteins.">Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins.</a> Prog. Lipid Res. 50, (2011).</li><li>Keinath, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAMP-induced+changes+in+plasma+membrane+compartmentalization+reveal+novel+components+of+plant+immunity.">PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity.</a> J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).</li><li>Stanislas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+proteomics+reveals+a+dynamic+association+of+proteins+to+detergent+resistant+membranes+upon+elicitor+signaling+in+tobacco.">Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).</li><li>Minami, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+detergent-resistant+plasma+membrane+microdomains+in+Arabidopsis+thaliana+during+cold+acclimation.">Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation.</a> Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).</li><li>Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mur1+mutation+on+xyloglucans+produced+by+suspension-cultured+Arabidopsis+thaliana+cells.">Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells.</a> Planta. 214, 67-74 (2001).</li><li>Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+synthesis+of+proteins+in+cell+suspensions+of+a+kinetin+dependent+tobacco.">Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco.</a> Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).</li><li>Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+plant+cell+cultures+with+K15NO3+as+a+tool+for+quantitative+analysis+of+proteins+and+metabolites.">Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites.</a> Plant Methods. 2, 1-11 (2006).</li><li>Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+heavy+nitrogen+in+quantitative+proteomics+experiments+in+plants.">The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants.</a> Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).</li><li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+And+Go+Extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization,+nanoelectrospray,+and+LC/MS+sample+pretreatment+in+proteomics.">Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).</li><li>Olsen, J. V., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+accuracy+mass+spectrometry+in+large-scale+analysis+of+protein+phosphorylation.">High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation.</a> Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).</li><li>Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neutral+loss+activation+method+for+improved+phosphopeptide+sequence+analysis+by+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometry.">A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).</li><li>Frese, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+peptide+identification+by+targeted+fragmentation+using+CID,+HCD+and+ETD+on+an+LTQ-Orbitrap+Velos.">Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos.</a> Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).</li><li>van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=StatQuant:+a+post-quantification+analysis+toolbox+for+improving+quantitative+mass+spectrometry.">StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).</li><li>Zauber, H., Schulze, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+wants+cRacker:+Automated+standardized+data+analysis+of+LC/MS+derived+proteomic+data.">Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data.</a> J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).</li><li>Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+annotation+of+remorins,+a+plant-specific+protein+family:+Evolutionary+and+functional+perspectives.">Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives.</a> Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).</li><li>Shah, M. B., Sehgal, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nondetergent+isolation+of+rafts.">Nondetergent isolation of rafts.</a> Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).</li><li>Persaud-Sawin, D. -. A., Lightcap, S., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+rafts+from+mouse+brain+tissue+by+a+detergent-free+method.">Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method.</a> Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).</li><li>Macdonald, L. J., Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+the+preparation+of+detergent-free+lipid+rafts.">A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts.</a> Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).</li><li>M&#252;hlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+shotgun+proteomics+using+a+uniform+15N-labeled+standard+to+monitor+proteome+dynamics+in+time+course+experiments+reveals+new+insights+into+the+heat+stress+response+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739 (2011).</li><li>Schulze, W., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+in+mass-spectrometry-based+proteomics.">Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).</li><li>Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+quantiative+proteomics+of+lipid+rafts+reveales+high+specificity+for+signaling+factors.">Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).</li><li>Lilley, K. S., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+organelle+proteomics.">Plant organelle proteomics.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).</li><li>Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-cellular+localization+of+membrane+proteins.">Sub-cellular localization of membrane proteins.</a> Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).</li></ol>

본 논문에서 제시하는 프로토콜은 여러 단계를 포함하고, 그들 모두는 세제 저항 막 및 세제 용해 분수에 식물 세포막의 순수하고 대표 분별을 얻을 매우 중요합니다. 따라서 지침에 따라 각 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 비 - 이온 성 세제 (단계 3.2)와 세포막 분획의 치료는 막 마이크로 도메인 분획의 품질에 강한 영향을 미친다. 상이한 제제 사이 재현 가능한 결과를 ?...

1972 년, 조나단 가수와 거스 니콜슨은 일반적으로 1960 년대 초에 허용 된 단백질 지질 단백질 샌드위치 모델을 교체, 유체 모자이크 모델에게 세포막의 구조 모델을 제안했다. 가수 니콜슨은 생체막 모든 지질 및 단백질 분자는 자유롭게하고 쉽게 확산 5 이차원 액체로서 고려 될 수 있음을 가정했다. 그때 이후로, 막 조성의 세포막 및 지식의 구조 모델은 더 복잡하게되었다. 특히, 세포막 내에 그러한 단백질 복합체 및 지질 / 스테롤 기반 구조적 무질서 같은 마이크로 도메인 구조를 관찰 할 수있다. 인공 모델 막을 6,7에서 스테롤과 스핑 고리 피드 가로 방향으로 변형 된 신체 기능과 영역을 형성하기 위해 다른 지질 종에서 분리 할 수 있습니다. 세포막 내에서이 분리는 주로 스테롤 높은 SA의 자기 연관 특성에 의해 발생합니다phopsho 및 스핑 고지 8 turated 탄화수소 사슬. 특히, 강성 스테롤 반지 엄격한 및 똑바로 포화 지질 종과 이들의 상호 작용이 막 두께와 경도를 증가, 더 확장 된 입체 형태로 이웃 탄화수소 사슬을 강제로와의 상호 작용을 선호. 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인의 일반적으로 관찰 된 기능 중 하나는 비 이온 계면 활성제 등의 트리톤 (Triton) X-100 BRIJ (35) 치료에 따라 자신의 불용성했다. 이 분획을 막 마이크로 도메인과 동일한 것으로 생각하고, 그들의 생화학 제조 방법 2에 따라 세제 저항 막 (DRM)라고했다. DRM 추출시 비이 온성 세제의 사용은 생화학 DRM 준비가 직접 사는 셀 (9) 내에서 특정 막 칸에 해당하지 않을 수 있으므로 약간의 비판을 받았다. 특히, 단백질의 비율 세제 등 준비에 중요한 것의 다른 세제뿐만 아니라 다른 세제 양의 세제 저항 막 분획 (10)의 다른 구성을 얻을 수 있습니다. 그러나, 특정 단백질의 종류는 특히 이러한 세포 스테롤이 풍부한 막 도메인과 연결하고,이 단백질이 잘 세제 저항 막 분수 (11)의 생화학 적 준비에 충실하는 증거가있다. 식물 DRM 분획에서 발견되었고,의 DRM에 존재 종속 스테롤했다하는 단백질의 핵심은, 이러한 fasciclin 같은 아라 비노 갈 락탄 단백질 (FLAs) 및 SKU 단백질 가족의 일원으로, 특히 GPI-고정 단백질이었다. 또한 수용체 같은 키나제 또는 포스 포 리파제 등 일부 신호 단백질은 11 발견되었다. 이러한 결과는 포유류 막 마이크로 도메인 12,13 많은 프로테오믹스 연구와 일치한다. 또한 식물에 스트레스 반응 (14)의 맥락에서 막 마이크로 도메인의 역할에 대한 증거가 증가하고있다 -16. 여기에 설명 된 프로토콜은 세포막 분획의 마이크로 도메인을위한 강력한 방법을 제공하고, 특히주세요 스테롤 풍부한 세포막 구획 4,11,14의 스트레스 유도 변화를 묘사 할 수의 세제 농도의 단백질을 사용한다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia (stock 25 % solution)</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>010-03166</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TiO2 10 &mu;m</td>
			<td>GL-Science</td>
			<td>5020-75010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore Disk C18</td>
			<td>Varian</td>
			<td>12145004</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol(PEG 3350)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>88276</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran T500</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9219.2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5113</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9599</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K15NO3</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>NLM-765-PK</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima L-80 XP Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LTQ-Orbitrap mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Speed Vac RVC 2-25</td>
			<td>Christ</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker Unimax 2010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic labeling and membrane fractionation for comparative proteomic analysis of arabidopsis thaliana suspension cell cultures

세포막 마이크로 도메인은 지질 및 스테롤 환경의 물리적 특성에 기초하여 기능하고 신호 전달 프로세스에서 특정 역할이있다. 프로테옴 분석을 위해 식물 세포에서 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인을 추출하면 여러 준비 단계 및 다른 세포 구획에서의 오염 물질에 대한 소스에 주로 어려운 작업입니다. 세포막은 식물 세포에있는 멤브레인의 단지 대략 5-20 %에 구성하고, 따라서 고순도 세포막 분획의 분리 도전적이다. 자주 사용하는 방법은 95 % (1)의 순도 세포막 소포를 산출 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스 트란의 수성 두 단계의 분할을 포함한다. 세포막 내 스테롤이 풍부한 막 마이크로 도메인은 알칼리 pH에서 차가운 비 이온 계 계면 활성제 치료에 불용성이다. 이 세제 저항 막 분획은 초 원심 분리에 의해 대량 세포막으로부터 분리 될 수있다ucrose 그라데이션 2. 이어서, 단백질은 메탄올 / 클로로포름 침전 자당 구배 저밀도 대역으로부터 추출 될 수있다. 추출 된 단백질은 소화 탈염 마지막 LC-MS/MS 분석 트립신됩니다. 스테롤이 풍부한 마이크로 도메인에 대한 우리의 추출 프로토콜은 애기 장대의 세포 배양에서 청소 세제 저항 막 분수의 준비를 위해 최적화되어 있습니다. 우리는 또한 3의 생물학적 처리 다음과 같은 정량적 인 비교 프로테오믹스 연구를위한 유일한 질소원으로 K 15 NO 3와 애기 장대 서스펜션 세포 배양의 전체 신진 대사 라벨을 사용합니다. 조인트 단백질 추출을위한 표지 및 표지되지 않은 세포 배양의 동등한 비율을 혼합하여 최종 정량 결과의 준비 단계의 영향은 최소로 유지된다. 또한 추출 중 물질의 손실은 제어와 같은 방법으로 처리 샘플 모두에 영향을 미칠 것이다D 따라서 빛과 올림 펩타이드의 비율이 일정하게 유지됩니다. 제안 된 방법으로 표시하거나 다른 컨트롤 4 역할을하면서 레이블이없는 세포 배양은 생물학적 처리를 거쳐 하나.

대사 적으로 표지 된 애기 세포 배양을 이용하여 제시된 프로토콜로는 식물 조직 (STEP2가, 2 및도 4)에서 원형질막을 분리하고, 세포막 내에 세제 저항 막 분획에 대한 풍부 할 수있다 (단계 3, 4 및도 5). 이어서, 프로토콜은 수있는 세제 저항 막 분획 (단계 4) 및 비교 프로테옴 분석 (단계 5)에 대한 단백질의 소화로부터 단백질의 추출. 마지막으로, 포스 포 (8 단계)의 ?...

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Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Research

JoVE Journal

Biology

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

Toxin Induction and Protein Extraction from Fusarium spp. Cultures for Proteomic Studies

에서 독소 유도와 단백질 추출 Fusarium 종.</emProteomic 연구> 문화

Fusaria are filamentous fungi able to produce different toxins. Fusarium mycotoxins such as deoxynivalenol, nivalenol, T2, zearelenone, fusaric acid, ...

연구

생물학

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::ÃƒÅ½Ã‚Â²-glucuronidase Reporter Gene Expression

의 꽃 - 물놀이 변환 Arabidopsis thaliana 검사 pTSO2 : β - glucuronidase 리포터 유전자 발현

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

류신 리치의 신진 대사 라벨링 방사성 인산과 키니 아제 1과 2를 반복

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

multiprotein의 단지의 비교 분석을위한 새로운 접근 방식을 기반으로<sup&gt; 15</sup&gt; N 대사 라벨링 및 정량 질량 분석

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

의 조직 화학 염색<em&gt; 애기 장대</em&gt; 차 전지 벽 요소

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

대사 프로파일의 실시간 분석<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 장내 크립트 Organoid 문화

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

장 내분비 세포의 굿 호르몬 분비의 연구 및 라이브 세포 이미징을위한 의도 된 쥐 소장의 혼합 차 문화

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells (Video) | JoVE 

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...