Name: an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization
Uploaded: 2013-08-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da borse di ricerca (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 e ARRA amministrative supplemento sovvenzioni NIH) a Weihong Lin. Noi in particolare ringraziamo il signor Tim Ford a UMBC per la sua assistenza tecnica in videoregistrazione e l&#39;elaborazione. Desideriamo inoltre ringraziare il Dott. Daphne Blumberg, la signora Chere Petty a UMBC e il signor Nicola McCollum da Olympus America Inc. per la loro assistenza materiale in videoregistrazione.

1. Topo Preparazione Naso Abbiamo usato adulto C57BL / 6 topi sfondo in questo studio. Tutte le cure e le procedure di animali sono approvati dalla cura degli animali e utilizzare i comitati (IACUC) della University of Maryland, Baltimore County. 1.1 Acquisire il naso da topi paraformaldahyde-fissi <img src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50538/50538fig1highres.jpg"/><b...

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Qui, abbiamo dimostrato una procedura passo-passo per isolare il tessuto olfattivo e respiratorio intatta dal naso mouse sequenzialmente rimuovendo le ossa circostanti, risparmiando il tessuto sottostante. Abbiamo dimostrato che un&#39;attenta rimozione ossea può conservare anche i tessuti più delicati nella loro interezza. Condividiamo anche spaccato eventuali modifiche di questa tecnica, in cui isolare sia il cervello e il tessuto naso insieme per preservare il collegamento nervo. Questo nuovo metodo fornisce un mez...

La cavità nasale mammiferi contiene vari tipi di tessuti ed organi che servono funzioni distinte. La cavità nasale costituisce la porzione di imbocco del tratto respiratorio superiore, che permette di viaggiare aria dentro e fuori i polmoni. Aria inalata passa attraverso la cavità nasale dove subisce temperatura e umidità condizionata 1 così come la pulizia o filtrazione per rimuovere sostanze irritanti e tossiche e microrganismi infettivi 2. Entrambi i trattamenti sono effettuati da nasale epiteli e tessuti subepiteliali, tra cui le ghiandole e vasi e sono fondamentali per la protezione delle vie respiratorie inferiori e dei polmoni. Oltre al suo ruolo nella respirazione e difesa epiteliale, il tessuto nasale contiene anche apparati sensoriali periferici dei sistemi olfattivi e trigemino, che rilevano una vasta gamma di sostanze chimiche in aria che passa. A seconda del sistema è attivato, il rilevamento sensoriale di sostanze chimiche nel naso può suscitare siaun senso di odore, irritazione o dolore 3,4. Il sistema olfattivo periferico è complesso e costituito da diversi organi sensoriali olfattivi anatomicamente separate all&#39;interno della cavità nasale. Tra questi, il principale epitelio olfattivo (MOE) è la più grande, che costituisce circa il 45-52% degli epiteli nasali nei roditori 5 e si trova nella regione posteriore. Nella regione anteroventrale, vi è una coppia di strutture tubolari noti come vomeronasal organo 6, che siedono lungo ogni lato del setto nasale. Altri due piccoli gruppi di neuroni sensoriali olfattivi, noto come l&#39;organo del setto di Masera 7,8 e il ganglio Gruneberg 9, risiedono lungo il setto ventrale e la regione dorsale ingresso della cavità nasale, rispettivamente. Questi organi periferici contengono neuro-epiteli con caratteristiche di spicco nella morfologia, espressione marcatore della cella, e la funzione fisiologica. Insieme, essi rilevano migliaia di odorimolecole con squisita sensibilità 10-12. Oltre agli organi sensoriali olfattivi, la cavità nasale ospita anche altri sistemi sensoriali. E &#39;noto che le fibre del nervo trigemino peptidergico sono presenti nell&#39;epitelio nasale, specialmente l&#39;epitelio respiratorio 13,14. Alcune di queste fibre di rilevare sostanze chimiche irritanti e tossici e sono responsabili per l&#39;avvio di riflessi protettivi come tosse e starnuti 4,15. Composti odorosi e amaro irritanti possono essere rilevati anche da una popolazione di cellule recentemente scoperto chemosensoriali solitarie (SCC), molti dei quali sono innervate da fibre nervose del trigemino 16-19. Questi SCC si trovano a maggiore densità nella zona ingresso della cavità nasale e delle vie d&#39;ingresso vomeronasali, suggerendo che esse possono servire anche una funzione protettiva 16-18. Così, epiteli nasali possono differire sostanzialmente in funzione, morfologia e composizione delle cellule a seconda della lorosedi anatomiche. Anche all&#39;interno di un unico e specializzato epitelio, ci sono differenze regionali. Il MOE è un esempio. Le linee MOE vari turbinati, che sono complicate e arricciati strutture. Grazie a loro, diverse regioni delle esperienze diverse portate d&#39;aria MOE e, quindi, diversa diffusione e di clearance delle molecole di odore nell&#39;aria 20. Inoltre, è noto che i neuroni sensoriali olfattivi (OSN) esprimenti un dato recettore odore sono situati in una delle quattro aggirato zone del MOE 21,22. Come questa differenza di posizione influenza la risposta di un OSN per odoranti non è ampiamente noto. Inoltre, alcune popolazioni OSN mostrano preferenza regionale. OSN guanylyl ciclasi-D (GC-D)-esprimenti hanno distribuzioni zonali favorendo le regioni cul-de-sac delle ectoturbinates 23,24. Più di recente, abbiamo trovato una sottopopolazione di OSN canoniche che esprime transitoria recettore potenziale canale M5 (trPM5) ed è preferenzialmente situati nelle regioni laterali e ventrali 25. Questi risultati indicano che MOE non è uniforme. Tuttavia, come queste differenze regionali influenzano codifica olfattivi non è compreso. Questo è in parte perché accurata indagine fisiologica del MOE e il naso è stato limitato dalla difficoltà di ottenere intatta nasale epiteli con organizzazione anatomica conservata con i metodi attuali. La nasale epiteli sono prevalentemente circondato dalle ossa anteriori del cranio, compreso il naso, mascella, palatino, zigomatico, e le ossa etmoidali. In topi adulti e altri modelli di roditori, queste ossa sono dure e difficili da rimuovere senza danneggiare il tessuto nasale strettamente associata, in particolare dei turbinati delicati. Spesso, decalcificazione chimici a base viene usato per ammorbidire le ossa per consentire criosezionamento dei tessuti nasali per morfologica, immunoistochimica, e in studi di ibridazione in situ, tuttavia, dipending l&#39;età dell&#39;animale, il processo di decalcificazione può durare durante la notte fino a 7 giorni 24,26-28. Questo trattamento è limitata anche perché richiede tessuto fissativo essere conservato. Inoltre, decalcificazione chimica può essere dura e influenzare la immunomarcatura di alcuni anticorpi sensibili 29,30. Per gli studi fisiologici, è richiesta tessuto vivo, e, quindi, questi esperimenti sono spesso condotti su OSN isolate o fette MOE ottenuti da neonati le cui ossa del cranio sono sottili e morbidi 17,31,32. Studi fisiologici possono anche utilizzare i preparati montare tutto, dividendo la testa 25,33,34, ma di solito solo la superficie mediale del naso è facilmente accessibile, limitando le registrazioni fisiologiche su altre aree. Qui, descriviamo un efficace metodo di disossamento manuale per preparare i tessuti nasali intatte con conservato organizzazione anatomica e morfologia. Noi sequenziale rimuoviamo le principali ossa del anterioreè necessaria cranio sotto un microscopio dissezione per esporre un epitelio nasale quasi totalmente intatto, mantenendo le sottili ossa turbinati intatto a meno che i topi sono molto vecchi e criosezionamento. Abbiamo anche estendere il metodo per conservare la connessione tra i tessuti nasali e bulbi olfattivi, così come il resto del cervello, facilitando così esame simultaneo di entrambi i circuiti periferici e centrali. Il nostro metodo può essere utilizzato per preparare paraformaldeide-fisso, nonché fresco, tessuto nasale vivo. Così, il nostro metodo è previsto per facilitare gli studi morfologici, immunoistochimici e fisiologici della respirazione, l&#39;olfatto, e nasale danni e malattia.

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 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
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 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Dissection</td>
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 <tr>
 <td>Rongeur, 1.0 mm Jaw width</td>
 <td>World Precision Instruments (WPI)</td>
 <td>501333</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 3 </td>
 <td>WPI</td>
 <td>503235 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont 55</td>
 <td>WPI</td>
 <td>14099</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine forceps, Dumont AA</td>
 <td>Fine Science Tools (FST)</td>
 <td>11210-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Specimen forceps, Serrated</td>
 <td>VWR</td>
 <td>82027-440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Operating scissors</td>
 <td>WPI</td>
 <td>501753</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iris scissors, Straight</td>
 <td>Miltex</td>
 <td>V95-304</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dissection microscope</td>
 <td>Olympus</td>
 <td>SZ40</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	<td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Tissue embedding</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optimum cutting temperature (OCT) compound</td>
 <td>Sakura Finetek</td>
 <td>4583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Plastic embedding mold</td>
 <td>VWR</td>
 <td>15160-215 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aspirator vacuum pump</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>09-960-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>[header]</td>
 </tr>
 <tr>
 	 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Section staining </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral red</td>
 <td>ACROS Organic</td>
 <td>CAS 553-24-2</td>
 <td>Nuclei staining</td>
 </tr>
</table>

an effective manual deboning method to prepare intact mouse nasal tissue with preserved anatomical organization

Il naso dei mammiferi è un organo multi-funzionale con le strutture interne complesse. La cavità nasale è rivestita con vari epiteli, come epiteli olfattivi, respiratori, e squamose che differiscono notevolmente in sedi anatomiche, morfologia e funzioni. In topi adulti, il naso è coperto con varie ossa del cranio, limitando l&#39;accesso sperimentale alle strutture interne, in particolare quelli del posteriore, come il principale epitelio olfattivo (MOE). Qui si descrive un metodo efficace per ottenere quasi tutto intatto e tessuti nasali con organizzazione anatomica conservata. L&#39;utilizzo di strumenti chirurgici sotto un microscopio da dissezione, abbiamo sequenziale rimuoviamo le ossa del cranio che circondano il tessuto nasale. Questa procedura può essere eseguita su entrambe le teste del mouse, dalla pelle paraformaldeide-fissi e appena sezionato. L&#39;intera procedura disossamento richiede circa 20-30 min, che è significativamente più breve del tempo richiesto per sperimentale convenzionale a base chimica decalcificazione. Inoltre, vi presentiamo un metodo semplice per rimuovere le bolle d&#39;aria intrappolate tra i turbinati, che è fondamentale per l&#39;ottenimento di sezioni orizzontali o coronale o sagittale sottili intatte dalla preparazione dei tessuti nasali. Tessuto nasale preparati usando il nostro metodo può essere utilizzato per tutta osservazione monte dell&#39;intero epiteli, nonché morfologica, immunocitochimica, RNA ibridazione in situ, e studi fisiologici, specialmente negli studi in cui regione specifica esame e confronto sono di interesse.

Usando questo metodo, si può attendibilmente ottenere tessuto nasale quasi completamente intatte. Figura 2A mostra un&#39;immagine esemplare adulto nasale da una testa paraformaldeide-fissa. In questo esemplare, tutti e quattro gli organi sensoriali sub-olfattive, tra cui il MOE, organo del setto, il ganglio Gruneberg e VNO, sono intatte. Inoltre, gli epiteli delle vie respiratorie e dei tessuti subepiteliali, come le ghiandole e vasi, sono conservati. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo in u...

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An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

Un efficace manuale disosso metodo per preparare intatto il mouse tessuto nasale con organizzazione anatomica Conservato

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Imaging in vivo e trattamenti terapeutici in un modello di mouse ortotopico di cancro ovarico

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Ricerca

Biologia

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Immunofluorescenza combinato e FISH DNA 3D conservato nuclei in interfase di studiare i cambiamenti in 3D Organizzazione nucleare

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybrid-Cut: Un metodo sezionamento migliorato per Recalcitrante tessuti vegetali Campioni

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

Differenza di potenziale nasale per quantificare il trasporto Trans-epiteliale ionico in topi

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

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Isolamento di Intact EyeBall per ottenere tessuto di superficie oculare integrale per l'esame istologico e l'immunoistochimica

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Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

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High-Throughput Contractile Measurements of Hydrogel-Embedded Intact Mouse Muscle Fibers Using an Optics-Based System

Misurazioni contrattili ad alta produttività di fibre muscolari di topo intatte incorporate in idrogel utilizzando un sistema basato sull'ottica

In vitro cell culture is a powerful tool to assess cellular processes and test therapeutic strategies. For skeletal muscle, the most common approaches ...