Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

وأيد هذا العمل جزئيا من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للسرطان، مركز لأبحاث السرطان؛ اتفاقية الأبحاث التعاونية بين لجنة التحقيق الوطنية وCalidris التداوي؛ جمعية السرطان الأمريكية منحة IRG 97-152-17 إلى OT؛ والأموال الاتحادية من المعهد الوطني للسرطان، المعاهد الوطنية للصحة، تحت HHSN26120080001E العقد.

1. إعداد الخلايا المحللة ويهدف هذا البروتوكول لخلايا ملتصقة تعرب عن أي بروتين GFP تنصهر. مطلوب عدد الخلايا يمكن أن تختلف من منخفضة تصل إلى 10 6 إلى ما يصل إلى 20 × 10 6 خلايا، اعتمادا على مستوى التعبير البروتين. على سبيل المثال...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

تعبير البروتين وتنقية هو خطوة شاقة ومكلفة، والتي، مع ذلك، من الضروري لتحديد التفاعلات &#39;K D بواسطة الأسلوب الأكثر المستخدمة حاليا. تطبيق يسمح MST تجنب تنقية البروتين وبالتالي تبسيط بشكل كبير وتسريع توصيف الكمي من التفاعلات. أنه يقدم مزايا كبيرة خاصة في حالة يصع?...

توصيف الكمي للتقارب من التفاعلات بين الجزيئات مهم في العديد من مجالات البحوث الطبية الحيوية. ملزمة التفكك المستمر (K D) أمر ضروري ليس فقط في اكتشاف المخدرات وإنما هو أيضا معلمة هامة في توصيف أي تفاعل ثنائي في أي نظام بيولوجي. أساليب الكيمياء الحيوية المستخدمة للكشف عن البروتين البروتين التفاعلات، مثل مناعي والخميرة شاشات هجين اثنين، لم يكن لاعلامنا على كيفية ضيق هي تلك التفاعلات، في حين يحدد ما إذا كان هذا التقارب مجمع خاص موجود تحت ظروف معينة في الجسم الحي. في عملية اكتشاف المخدرات، والتنمية مقايسة ملزمة هي واحدة من اللازم وغالبا من أشد الخطوات تستغرق وقتا طويلا. الأساليب الأكثر استخداما من K D عزم تشمل الاستقطاب مضان، 1 سطح مأكل صدى (SPR) والتكنولوجيا، 2 اللاجن ملزم، 3 متساوي الكالوري المعايرة، 4 equilibriأم غسيل الكلى (ED)، 5 الترشيح الفائق (UF) و 5 و تنبيذ فائق (UC). 6 فجميعها تتطلب كميات كبيرة من البروتين النقي الهدف. thermophoresis الميكروسكيل (MST) هي طريقة سريعة النمو الذي يكشف حركة موجهة من الجزيئات في التدرج في درجة الحرارة المجهرية. أي تغييرات من قذيفة الماء من الجزيئات الحيوية نتيجة في التغير النسبي للحركة على طول التدرج في درجة الحرارة. يستخدم 7 MST لتحديد الانتماءات الملزمة وأنها طبقت لدراسة يجند ملزم للبروتينات fluorescently المسمى أو بروابط الفلورسنت لبروتين الهدف. 8، 9 MST يسمح قياس التفاعلات مباشرة في حل من دون الحاجة إلى تجميد على سطح (خالية من الشلل التكنولوجيا). عمليا، ويرافق أي ملزم عن تغيير في إشارة MST، على الرغم من أن حجم التغيير يختلف من نظام إلى نظام بشكل كبير. للكشف عن حركة جزيء بواسطة MST، فإنها يجب أن تكون يتألقNT. ويمكن تشغيل هذا القيد الرئيسي للطريقة إلى ميزة. إذا يتم التعبير عن بروتين كما التحام GFP في أي نظام، وسوف يكون جزيء نيون فقط، وبالتالي يمكن دراستها دون بمعزل عن المحللة الخلية أو نظام خالية من الخلايا التعبير. توليد لست] الخلية التي تسمح للظروف ملزمة مع الحد الأدنى من القطع الأثرية هو التحدي الرئيسي. نحن هنا وصف بروتوكول من إعداد المحللة الخلية والتجربة MST التي يمكن استخدامها للعديد من البروتينات القابلة للذوبان والغشاء. هي كامنة البروتينات STAT عوامل النسخ حشوية تفعيلها من خلال الفسفرة التيروزين في استجابة لإشارات خارج الخلية وتشارك في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الحصانة، تكون الدم، والالتهابات، والتنمية 10 في الثدييات، وتتكون الأسرة من STAT STAT 1، 2، 3، 4 ، 5A، 5B، و 6. ومن المعروف أن جميع الإحصائيات تفعيلها لربط تسلسل الحمض النووي نفسه، ما يسمى عزر GAS، الإنترفيرون جاما تنشيط تسلسل. ومع ذلك، فإن transcriآثار ptional من الإحصائيات المختلفة هي مختلفة جدا. 11 وعلى الرغم من تورط في العديد من العمليات المرضية ودراسات مستفيضة مما أسفر عن أكثر من 17،000 المنشورات، لم يتم تحديد K D من التفاعلات STAT مع تسلسل الحمض النووي مختلفة. وقد اتسمت فقط تقارب النسبي للإحصائيات مختلفة لأنواع من عزر الغاز. صعوبات في التعبير 11 البروتين وتنقية هي العوائق الرئيسية في توصيف الحمض النووي الانتقائية الإحصائيات &#39;ملزمة. على الرغم من أن الغالبية العظمى من الدراسات ركزت على دور الإحصائيات &quot;المنشط&quot;، الذي أصبح مرادفا للعامل النسخ صور-فسفرته، ودور الإحصائيات غير فسفرته (U-الإحصائيات) في تنظيم النسخ تبرز بسرعة 12 ومع ذلك، هذه الآليات غير مفهومة جيدا، ولكن لم يتضح ما إذا كانت U-الإحصائيات ربط الواقع على الحمض النووي أو التصرف من خلال التفاعلات مع عوامل النسخ الأخرى. لقد أظهرنا مؤخرا أن U-STAT3 يمكن ربط الحمض النووي sequenCES مختلفة من الزخارف الغاز مع أعلى حتى تقارب 13 هذه النتيجة لها انعكاسات كبيرة على فهمنا للالوظائف البيولوجية من هذا البروتين مهم. لقد طبقنا thermophoresis الميكروسكيل لتحديد الانتماءات النسبية للSTAT3 إلى الغاز وAT-S الغنية قليل النوكليوتيد +100 (الشكل 4). وقد استخدم بروتوكول متطابقة تقريبا لK D تقرير للربط ليجند STAT3 مختلفة، مثبط lipopeptide 14 لا ملزم للعامل النسخ ذات الصلة، GFP-STAT1 الذي تم استخدامه كعنصر تحكم سلبي يمكن أن يتم الكشف عن مما يؤكد الانتقائية من التفاعل. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

توصيف الكمي للتفاعلات البروتين ضروري عمليا في أي مجال من مجالات علوم الحياة، وخاصة اكتشاف المخدرات. معظم الطرق المتاحة حاليا من K D تقرير تتطلب الوصول إلى تنقية البروتين من الفائدة، الجيل الذي يمكن أن يكون مضيعة للوقت ومكلفة. لقد قمنا بتطوير البروتوكول الذي يسمح لتحديد تقارب ملزمة من قبل thermophoresis الميكروسكيل (MST) من دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. ينطوي على طريقة overexpression من البروتين GFP تنصهر وتحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف. تطبيق طريقة لSTAT3-GFP أعرب عابر في HEK293 الخلايا يسمح لتحديد لأول مرة تقارب من عامل النسخ مدروسة لأليغنوكليوتيد] مع سلاسل مختلفة. بروتوكول واضح وصريح ويمكن أن يكون لها مجموعة متنوعة من التطبيقات لدراسة التفاعلات بين البروتينات مع جزيئات صغيرة، الببتيدات، DNA، RNA، وProteins.

قياس تقارب من البروتين STAT3 غير فسفرته ملزمة لأليغنوكليوتيد]. واستخدمت HEK293 الخلايا معربا عن GFP STAT3-كمصدر للfluorescently المسمى STAT3 لفحص الحمض النووي ملزم. أعدت لست] الخلية باستخدام RIPA العازلة (20X10 6 خلية / مل). للدراسات ملزم، و?...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

thermophoresis الميكروسكيل (MST) يمكن استخدامها على نطاق واسع لتحديد تقارب ملزمة دون تنقية البروتين المستهدف من الخلية لست. البروتوكول ينطوي overexpression من البروتين GFP تنصهر، تحلل الخلية في غير تغيير طبيعة الظروف، والكشف عن إشارة MST في وجود تركيزات من يجند متفاوتة.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

عزل بروتين المجمعات المتعددة التي كتبها عطوب في الجسم الحي الشواهد الخلوية عبر ربط والمناعة المغناطيسي اللوني التقارب

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

متعامد تنقية البروتين الميسر عن طريق بطاقات تقارب Bispecific الصغيرة

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

تحديد الشركاء البروتين عن طريق التفاعل جنبا الى جنب الانجذاب تنقية

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

في الوقت الحقيقي تحليلات النقل الريتينول بواسطة مستقبلات البروتين غشاء البلازما الريتينول ملزم

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

بروتوكول لفج العرض وتقارب اختيار طريق الطعوم البروتين المؤتلف

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...