Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Dette arbejde blev delvist støttet af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, Collaborative Research Aftale mellem NCI og Calidris Therapeutics, American Cancer Society tilskud IRG 97-152-17 til OT og føderale midler fra National Cancer Institute, NIH, under kontrakt HHSN26120080001E.

1.. Fremstilling af cellelysat Denne protokol er beregnet til adhærente celler, der udtrykker enhver GFP-fusioneret protein. Nødvendigt celletal kan variere fra så lavt som 10 6 til så mange som 20 x 10 6 celler, afhængigt af niveauet af protein-ekspression. For eksempel blev lysat af HEK-celler overudtrykker GFP-STAT3 fremstilles ved behandling af celler dyrket i 10 T75 kolber til nær 70% sammenflydning med 1 ml lysisbuffer. Men denne lysat måtte fortyndes 150 gan...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Proteinekspression og oprensning er en omstændelig og dyr trin, som er imidlertid nødvendig til bestemmelse af interaktioner &#39;K D af mest anvendte metode. Anvendelse af MST tillader undgå proteinoprensning dermed væsentligt forenkle og fremskynde kvantitativ karakterisering af interaktioner. Den præsenterer særligt betydelige fordele i tilfælde af svære at udtrykke og oprense proteiner, såsom membranproteiner og transkriptionsfaktorer. Den største begrænsning og kra...

Kvantitative karakterisering af affinitet intermolekylære vekselvirkninger er vigtig i mange områder af biomedicinsk forskning. Bindende dissociationskonstant (K D) er væsentligt ikke kun i lægemiddelforskning, men er også en vigtig parameter i karakterisering af enhver binær interaktion i ethvert biologisk system. Biokemiske metoder til påvisning af protein-protein interaktioner, såsom immunoprecipitation og gær, to-hybrid skærme, ikke informere os om, hvordan stramt er de interaktioner, mens affinitet definerer, om denne særlige kompleks eksisterer under givne betingelser in vivo. I lægemiddelforskning processen er bindende assay udvikling en af ​​de nødvendige og ofte er de mest tidskrævende trin. Mest almindeligt anvendte metoder til K D bestemmelse omfatter fluorescenspolarisering, 1 overflade (SPR) teknologi, 2 radioligandbinding, 3 thermo titrering kalorimetri, 4 equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltrering (UF), 5 og ultracentrifugering (UC). 6. Alle af dem kræver betydelige mængder af renset målprotein. Mikroskala thermophoresis (MST) er en rivende udvikling metode, der registrerer rettet bevægelse af molekyler i en mikroskopisk temperaturgradient. Eventuelle ændringer i hydrering skallen af biomolekyler resulterer i en relativ ændring af bevægelse langs temperaturgradient. 7. MST anvendes til at bestemme bindingsaffiniteter og er blevet anvendt til at studere ligandbinding til fluorescensmærkede proteiner eller fluorescerende ligander til et målprotein. 8, 9 MST tillader måling af interaktioner direkte i opløsning uden behov for immobilisering på en overflade (immobilisation-fri teknologi). Praktisk er nogen bindende ledsaget af en ændring i MST-signal, selvom størrelsen af ​​ændringen forskellig fra system til system betydeligt. Til påvisning af molekylet bevægelse ved MST, skal de være fluorescerernt. Denne store begrænsning af metoden kan vendes til en fordel. Hvis proteinet udtrykkes som et GFP-fusion i ethvert system, vil det være den eneste fluorescerende molekyle og kan således studeres uden isolering fra cellelysatet eller cellefrit ekspressionssystem. Generering af cellelysater der giver mulighed for bindende betingelser med minimale artefakter er den store udfordring. Her beskriver vi en protokol cellelysat forberedelse og MST eksperiment, der kan bruges til mange opløselige og membranproteiner. STAT-proteiner er latente cytoplasmiske transkriptionsfaktorer aktiveres af tyrosinphosphorylering som respons på ekstracellulære signaler og er involveret i mange biologiske processer, herunder immunitet, hæmatopoiese, inflammation og udvikling. 10. I pattedyr STAT familien består af STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B og 6. Alle aktiverede STATs er kendt for at binde til den samme DNA-sekvens, såkaldt GAS motiv, IFN-gamma aktiveret sekvens. Imidlertid transcriptional virkninger af forskellige statistikinterval er meget anderledes. 11. På trods af engagement i mange patologiske processer og omfattende undersøgelser der giver over 17.000 publikationer, har K D STAT interaktioner med forskellige DNA-sekvenser ikke blevet bestemt. Kun relative affinitet forskellige statistik til varianter af GAS motiv er blevet karakteriseret. 11 Vanskeligheder med protein ekspression og oprensning er de store hindringer i karakterisering af Stats »DNA bindende selektivitet. Selv om de fleste af de undersøgelser har fokuseret på den rolle &quot;aktiveret&quot; Stats, der blev synonym til Tyr-phosphoryleret transskription faktor, rolle ikke-phosphoryleret STATs (U-stats) i regulering af transskription er ved at opstå hurtigt. 12. Imidlertid disse mekanismer er dårligt forstået, og det var uklart, om U-Stats faktisk binder sig til DNA eller handle gennem interaktioner med andre transkriptionsfaktorer. Vi har for nylig vist, at U-STAT3 kan binde til DNA sekventielleces forskellig fra GAS motiver med endnu højere affinitet. 13. Konstateringen har betydelige konsekvenser for vores forståelse af de biologiske funktioner af dette vigtige protein. Vi har anvendt mikroskala thermophoresis at bestemme relative affiniteter STAT3 til GAS og AT-rige oligonukleotid S +100 (Figur 4). Næsten identisk protokol er blevet anvendt til K D bestemmelse for binding af et andet STAT3 ligand, en lipopeptid inhibitor. 14. Ingen binding til en beslægtet transkriptionsfaktor, GFP-STAT1 der blev anvendt som en negativ kontrol kunne påvises således bekræfter selektiviteten af interaktion. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Kvantitative karakterisering af protein interaktioner er afgørende i næsten ethvert område af biovidenskab, især lægemiddelforskning. De fleste af tiden tilgængelige metoder til K D bestemmelse kræver adgang til oprenset protein af interesse, generation, som kan være tidskrævende og dyrt. Vi har udviklet en protokol, der giver mulighed for bestemmelse af bindingsaffiniteten mikroskala thermophoresis (MST) uden oprensning af målproteinet fra cellelysater. Fremgangsmåden involverer overekspression af GFP-fusionerede protein og cellelysis i ikke-denaturerende betingelser. Anvendelse af metoden til STAT3-GFP udtrykt transient i HEK293-celler lov til at bestemme for første gang affiniteten af ​​velundersøgte transkriptionsfaktor til oligonukleotider med forskellige sekvenser. Protokollen er ligetil og kan have en bred vifte af ansøgning om at studere interaktioner af proteiner med små molekyler, peptider, DNA, RNA, og proteins.

Måling af affiniteten af ikke-phosphoryleret STAT3 proteinbinding til oligonukleotider. HEK293 celler, der udtrykker STAT3-GFP blev anvendt som en kilde for fluorescensmærket STAT3 for DNA bindingsassay. Cellelysater blev fremstillet ved hjælp af RIPA-buffer (20x10 6 celler / ml). For bindingsundersøgelser blev lysaterne fortyndedes 150x med MST DNA-bindingspuffer for at give det optimale niveau af det fluorescerende protein i bindingsreaktionen (ca. 20 nM). Ikke...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikroskala thermophoresis (MST) kan anvendes bredt til bestemmelse af bindingsaffinitet uden oprensning af målproteinet fra cellelysater. Protokollen involverer overekspression af GFP-fusioneret protein, cellelyse i ikke-denaturerende betingelser, og påvisning af MST signal i nærvær af varierende koncentrationer af liganden.

Protein Purification-fri metode til Binding Affinity Bestemmelse ved Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonale Proteinoprensning Faciliteret af en lille Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifikation af Protein Interagerende Partners Brug Tandem Affinitetsrensning

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time Analyser af Retinol Transport af membranen Receptor af Plasma retinolbindingsprotein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

En protokol for fagvisning og Affinity Selection Brug rekombinant protein Lokkemad

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...