Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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Ce travail a été partiellement financé par le Programme de recherche intra-muros des NIH, l&#39;Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer; accord de recherche collaborative entre le NCI et Calidris Therapeutics; American Cancer Society subvention IRG 97-152-17 à OT, et les fonds fédéraux de l&#39; National Cancer Institute, NIH, sous HHSN26120080001E du contrat.

1. Préparation de lysat cellulaire Ce protocole est destiné aux cellules adhérentes exprimant une protéine GFP fusionnée. Nombre de cellules nécessaire peut varier entre un minimum de 10 6 à moins de 20 x 10 6 cellules, en fonction du niveau d&#39;expression de la protéine. Par exemple, lysat de cellules HEK surexprimant GFP-STAT3 a été préparé par le traitement des cellules cultivées dans 10 flacons T75 à près de 70% de confluence avec le tampon de lyse 1 ...

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

expression et purification de protéines est une étape laborieuse et coûteuse, ce qui est, cependant, nécessaire pour la détermination de K D interactions par la méthode la plus couramment utilisée. Application des MST permet d&#39;éviter la purification de protéines ce qui simplifie considérablement l&#39;accélération et la caractérisation quantitative des interactions. Il présente des avantages particulièrement importants dans le cas de difficile à exprimer et purifier des protéines telles q...

Caractérisation quantitative de l&#39;affinité des interactions intermoléculaires est important dans de nombreux domaines de la recherche biomédicale. Reliure constante de dissociation (K D) est essentiel non seulement dans la découverte de médicaments, mais est également un paramètre important dans la caractérisation d&#39;une interaction binaire dans un système biologique. Méthodes biochimiques utilisées pour la détection des interactions protéine-protéine, comme immunoprécipitation et de la levure de deux écrans hybrides, ne nous informent pas sur la façon dont ces interactions sont serrés, tout en affinité définit si ce complexe particulier existe dans des conditions données in vivo. En processus de découverte de médicaments, le développement de test de liaison est l&#39;un des nécessaire et fréquemment étapes les plus fastidieuses. La plupart des méthodes couramment utilisées pour la détermination K D incluent la polarisation de fluorescence, 1 surface technologie résonance de plasmon (SPR), 2 radioligand contraignant, 3 isotherme calorimétrie de titration, 4 Equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltration (UF), 5 et ultracentrifugation (UC). 6 Chacun d&#39;entre eux nécessitent des quantités importantes de protéine cible purifiée. Thermophorèse Microscale (MST) est un procédé en plein développement qui détecte un mouvement dirigé de molécules dans un gradient de température microscopique. Toute modification de la couche d&#39;hydratation des biomolécules entraînent un changement relatif du mouvement le long du gradient de température. 7 MST est utilisé pour déterminer les affinités de liaison et a été appliquée pour l&#39;étude de la liaison du ligand à des protéines marquées par fluorescence ou ligands fluorescents pour une protéine cible. 8, 9 MST permet de mesurer les interactions directement en solution sans la nécessité d&#39;immobilisation sur une surface (immobilisation sans technologie). Pratiquement, toute liaison est accompagnée d&#39;un changement dans le signal MST, même si la taille du changement diffère d&#39;un système à façon significative. Pour la détection de mouvement de la molécule par MST, ils doivent être fluorescentnt. Cette limitation majeure de la méthode peut être transformé en un avantage. Si une protéine est exprimée comme une fusion de la GFP dans tout système, il sera la seule molécule fluorescente et peut donc être étudié sans les isoler du lysat cellulaire ou un système d&#39;expression acellulaire. Génération de lysats de cellules qui permettent de conditions contraignantes avec le minimum d&#39;artefact est le défi majeur. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lysat cellulaire et l&#39;expérimentation MST qui peut être utilisé pour de nombreuses protéines solubles et membranaires. Protéines STAT sont latents facteurs de transcription cytoplasmiques activés par phosphorylation sur tyrosine en réponse à des signaux extracellulaires et sont impliqués dans de nombreux processus biologiques, y compris l&#39;immunité, l&#39;hématopoïèse, l&#39;inflammation et le développement. 10 Chez les mammifères, la famille STAT se compose de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B et 6. Toutes les stats activés sont connus pour se lier à la même séquence d&#39;ADN, dite motif de GAZ, IFN-gamma activé séquence. Toutefois, le transcriptionnel effets de différentes stats sont très différents. 11 En dépit de l&#39;implication dans de nombreux processus pathologiques et des études approfondies produisant plus de 17.000 publications, le K D d&#39;interactions STAT avec différentes séquences d&#39;ADN n&#39;ont pas été déterminées. Seulement affinité relative des différentes variantes de stats pour motif de gaz a été caractérisé. 11 Difficultés d&#39;expression et purification des protéines sont les principaux obstacles à la caractérisation de sélectivité de liaison de l&#39;ADN stats. Bien que la majorité des études se sont concentrées sur le rôle des stats &quot;activés&quot;, qui est devenu synonyme de facteur de transcription Tyr phosphorylée, le rôle de STATS non phosphorylée (U-STAT) dans la régulation de la transcription émerge rapidement. 12 Cependant, ces mécanismes sont encore mal compris, et il était difficile de savoir si U-stats lie effectivement à l&#39;ADN ou d&#39;agir à travers des interactions avec d&#39;autres facteurs de transcription. Nous avons récemment montré que U-STAT3 peut se lier à l&#39;ADN séquentielleCES différente de motifs de gaz avec une affinité encore plus élevé 13. L&#39;découverte a des implications importantes pour notre compréhension des fonctions biologiques de cette protéine importante. Nous avons appliqué thermophorèse microscopique afin de déterminer les affinités relatives de STAT3 au gaz et au riche oligonucléotide S +100 (Figure 4). Protocole pratiquement identique a été utilisée pour la détermination de K D pour la liaison d&#39;un ligand STAT3 différent, un inhibiteur de lipopeptides. 14 Aucune liaison pour un facteur de transcription liée, GFP-STAT1 qui a été utilisé comme contrôle négatif a pu être détecté confirmant ainsi la sélectivité d&#39;interaction. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caractérisation quantitative des interactions protéine est essentielle dans pratiquement tous les domaines des sciences de la vie, en particulier la découverte de médicaments. La plupart des méthodes actuellement disponibles de détermination K D nécessitent un accès à la protéine d&#39;intérêt, la production de ce qui peut être fastidieux et coûteux purifiée. Nous avons mis au point un protocole qui permet de déterminer l&#39;affinité de liaison par thermophorèse microscopique (MST) sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le procédé implique une surexpression de la protéine GFP-condensé et la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes. Application de la méthode de STAT3-GFP exprimé de manière transitoire dans les cellules HEK293 ont permis de déterminer pour la première fois l&#39;affinité du facteur de transcription bien étudiée pour des oligonucléotides avec des séquences différentes. Le protocole est simple et peut avoir une variété d&#39;applications pour l&#39;étude des interactions des protéines avec de petites molécules, les peptides, ADN, ARN, et proteins.

Mesure de l&#39;affinité de non-phosphorylée protéine STAT3 liaison à oligonucléotides. Cellules HEK293 exprimant STAT3-GFP ont été utilisés comme source d&#39;marqué par fluorescence STAT3 pour dosage de liaison ADN. lysats cellulaires ont été préparés en utilisant un tampon RIPA (20x10 6 cellules / ml). Pour les études de liaison, les lysats ont été dilués 150x avec MST tampon liaison à l&#39;ADN pour assurer le niveau optimal de la protéine fluo...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Thermophorèse Microscale (MST) peut être largement utilisé pour la détermination de l&#39;affinité de liaison sans purification de la protéine cible à partir de lysats cellulaires. Le protocole implique une surexpression de la protéine GFP-condensé, la lyse des cellules dans des conditions non dénaturantes, et la détection des signaux HNR en présence de concentrations variables du ligand.

Protein Purification méthode sans la détermination de l&#39;affinité de liaison par thermophorèse Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

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