Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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Collaborative Research Agreement zwischen NCI und Calidris Therapeutics;; American Cancer Society Zuschuss IRG 97-152-17 auf OT und Bundesmittel aus dem Diese Arbeit wurde teilweise durch die Interne Research Program des NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt National Cancer Institute, NIH, unter Vertrag HHSN26120080001E.

1. Herstellung von Cell Lysate Dieses Protokoll wird für adhärente Zellen, die keine GFP-Fusionsprotein bestimmt. Benötigte Zellzahl kann von so niedrig wie 10 6 bis zu 20 x 10 6 Zellen je nach dem Niveau der Proteinexpression. Zum Beispiel wurde Lysat von HEK-Zellen überexprimiert GFP-STAT3 durch Behandlung von Zellen in 10 T75-Flaschen gezüchtet nahe 70% Konfluenz mit 1 ml Lysepuffer. Dies hatte jedoch Lysat verdünnt 150-fache auf optimale Niveau der Fluoreszenz f...

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	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Proteinexpression und-reinigung ist aufwendig und teuer Schritt, das ist jedoch notwendig, zur Bestimmung der Wechselwirkungen &#39;K D von den meisten derzeit verwendeten Verfahren. Anwendung von MST ermöglicht die Vermeidung Proteinreinigung damit deutlich vereinfacht und beschleunigt quantitative Charakterisierung von Wechselwirkungen. Es stellt besonders deutliche Vorteile bei schwer Expression und Aufreinigung von Proteinen, wie Membranproteine ​​und Transkriptionsfaktoren. <p class="jove_conten...

Quantitative Charakterisierung der Affinität von intermolekularen Wechselwirkungen ist in vielen Bereichen der biomedizinischen Forschung wichtig. Binding Dissoziationskonstante (K D) ist wichtig, nicht nur in der Wirkstoffforschung, sondern ist auch ein wichtiger Parameter bei der Charakterisierung eines binären Wechselwirkung in einem biologischen System. Biochemische Methoden zum Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen eingesetzt werden, wie Immunpräzipitation und Hefe-Zwei-Hybrid-Screens, uns nicht informieren, wie eng sind diese Wechselwirkungen, während Affinität definiert, ob diese besondere Komplex unter gegebenen Bedingungen in vivo vorliegt. In Drug Discovery-Prozess, ist bindend Assay-Entwicklung eine der notwendigen und häufig den zeitaufwendigen Schritte. Die am häufigsten verwendeten Methoden der K D Bestimmung gehören Fluoreszenz Polarisation, 1 Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Technologie, 2 Radioligandenbindung, 3 isothermen Titrationskalorimetrie, 4 Gleichgewichtsum Dialyse (ED), 5 Ultrafiltration (UF), 5 und Ultrazentrifugation (UC). 6 Alle von ihnen erfordern erhebliche Mengen von gereinigtem Zielprotein. Microscale Thermophorese (MST) ist eine sich schnell entwickelnde Verfahren die gerichtete Bewegung von Molekülen in einem mikroskopischen Temperaturgradienten ermittelt. Änderungen der Hydrathülle von Biomolekülen zu einer relativen Änderung der Bewegung entlang des Temperaturgradienten. 7 MST wird verwendet, um Bindungsaffinitäten zu bestimmen und ist für die Untersuchung Ligandenbindung an fluoreszenzmarkierten Proteinen oder fluoreszierenden Liganden an ein Zielprotein angewendet. 8, 9 MST ermöglicht die Messung von Wechselwirkungen direkt in Lösung ohne die Notwendigkeit der Immobilisierung auf einer Oberfläche (Immobilisierung-freie Technik). Praktisch ist jede Bindung durch eine Änderung in der MST-Signal begleitet, obwohl die Größe der Veränderung unterscheidet sich von System zu System deutlich. Für den Nachweis von Molekülen durch Bewegung MST, haben sie zu fluoreszierennt. Diese wesentliche Einschränkung des Verfahrens kann in einen Vorteil ausgeschaltet werden. Wenn ein Protein als ein GFP-Fusionsprotein in einem System exprimiert wird, wird es das einzige fluoreszierende Molekül sein und kann somit ohne Isolierung aus dem Zelllysat oder zellfreies Expressionssystem untersucht werden. Generierung von Zelllysaten, die für die Bindung Bedingungen erlauben mit minimalen Artefakten ist die große Herausforderung. Hier beschreiben wir ein Protokoll Zelllysat Vorbereitung und MST Experiment, das für viele lösliche und Membranproteinen verwendet werden können. STAT-Proteine ​​zytoplasmatischen Transkriptionsfaktoren Tyrosinphosphorylierung in Reaktion auf extrazelluläre Signale aktiviert sind latent und werden in vielen biologischen Prozessen einschließlich Immunität, Hämatopoese, Entzündung und Entwicklung. 10 In Säugetieren beteiligt besteht der STAT-Familie STAT 1, 2, 3, 4 5A, 5B und 6. Alle aktivierten STATs bekannt sind, um zu der gleichen DNA-Sequenz zu binden, sogenannten GAS-Motiv, IFN-gamma-Sequenz aktiviert. Allerdings ist die transcriptional Auswirkungen verschiedener STATs sind sehr unterschiedlich. 11 Trotz der Beteiligung an vielen pathologischen Prozessen und umfangreiche Untersuchungen was als 17.000 Publikationen wurden die K D von STAT Wechselwirkungen mit anderen DNA-Sequenzen nicht bestimmt worden. Nur relative Affinität von verschiedenen STATs Varianten von GAS Motiv charakterisiert worden. Schwierigkeiten in 11 Proteinexpression und-reinigung sind die größten Hindernisse bei der Charakterisierung von STATs &#39;DNA-Bindung Selektivität. Obwohl die Mehrzahl der Studien über die Rolle der &quot;aktivierten&quot; stats, die ein Synonym für Tyr-phosphorylierten Transkriptionsfaktor wurde, die Rolle der nicht-phosphorylierten STATs (U-Stats) bei der Regulation der Transkription konzentriert haben sich rasch. Jedoch 12, Diese Mechanismen werden kaum verstanden, und es war unklar, ob U-STATs tatsächlich an DNA binden oder wirken durch Wechselwirkungen mit anderen Transkriptionsfaktoren. Wir haben kürzlich gezeigt, dass U-STAT3 an DNA binden sequences anders GAS Motive mit noch höherer Affinität. 13. Der Befund hat erhebliche Auswirkungen für unser Verständnis der biologischen Funktionen dieses wichtigen Proteins. Wir haben Mikrobereich Thermophorese zu relativen Affinitäten von STAT3 zu GAS bestimmen aufgebracht und AT-reiche Oligonukleotid S +100 (Abbildung 4). Nahezu identische Protokoll wurde für K D Bestimmung wurde für die Bindung von einem anderen STAT3 Ligand, ein Lipopeptid-Hemmer. 14 keine Bindung an eine verbundene Transkriptionsfaktor, GFP-STAT1, das als negative Kontrolle verwendet wurde nachgewiesen werden konnte bestätigt damit die Selektivität der Wechselwirkung werden. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Quantitative Charakterisierung von Protein-Wechselwirkungen ist wichtig, in praktisch jedem Bereich der Biowissenschaften, insbesondere der Wirkstoffforschung. Die meisten der derzeit verfügbaren Methoden der K D Bestimmung benötigen Zugriff auf gereinigtes Protein von Interesse, die Erzeugung von denen zeitaufwändig und teuer werden kann. Wir haben ein Protokoll, das zur Bestimmung der Bindungsaffinität von mikroskaligen Thermophorese (MST) ermöglicht ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten entwickelt. Das Verfahren beinhaltet die Überexpression des GFP-Fusionsprotein und Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen. Anwendung des Verfahrens zur STAT3-GFP transient in HEK293 Zellen erlaubt erstmals die Affinität der gut untersuchten Transkriptionsfaktors an Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen bestimmen ausgedrückt. Das Protokoll ist einfach und kann eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten für auf Interaktionen von Proteinen mit kleinen Molekülen, Peptiden, DNA, RNA haben und proteins.

Messung der Affinität der nicht-phosphorylierten STAT3-Protein-Bindung an Oligonukleotide. HEK293-Zellen, die STAT3-GFP wurde als eine Quelle von fluoreszenzmarkierten STAT3 für DNA-Bindungstest verwendet. Zelllysate wurden unter Verwendung RIPA Puffer (20x10 6 Zellen / ml). Für Bindungsstudien wurden die Lysate verdünnt 150x mit MST DNA-Bindungspuffer auf das optimale Niveau des fluoreszierenden Proteins in der Bindungsreaktion (etwa 20 nm) zu liefern. Nicht-tra...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microscale Thermophorese (MST) kann in weiten Bereichen zur Bestimmung der Bindungsaffinität werden ohne Reinigung des Zielproteins aus Zelllysaten. Das Protokoll umfasst die Überexpression des GFP-Fusionsprotein, Zell-Lyse in nicht-denaturierenden Bedingungen, sowie Erkennung MST Signal in der Gegenwart von variierenden Konzentrationen des Liganden.

Protein Purification-freie Methode der Bindungsaffinität Bestimmung durch Microscale Thermophorese

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Mikrovolumen Proteinkonzentrationsbestimmung mit dem NanoDrop 2000c Spektrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Forschung

Biologie

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolierung von Labile Multi-Protein-Komplexe durch In vivo Kontrollierte Cellular Cross-Linking und Immuno-magnetische Affinitätschromatographie

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemische Rekonstitution der Steroid-Rezeptor • Hsp90-Protein-Komplexen und Reaktivierung der Ligandenbindung

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

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Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

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Identifizierung von Protein Interaktionspartner mittels Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

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Real-time Analyse von Retinol Transport durch die Membran-Rezeptor von Plasma Retinol Binding Protein

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A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...