Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון לאומי לסרטן, מרכז לחקר הסרטן; הסכם המחקר משותף בין NCI וTherapeutics Calidris; האגודה האמריקנית לסרטן מענק IRG 97-152-17 לOT; וכספים פדרליים מ המכון לאומי לסרטן, NIH, תחת HHSN26120080001E החוזה.

1. הכנת lysate התא פרוטוקול זה מיועד לתאים חסיד מבטאים כל חלבון ה-GFP-התמזגו. מספר תא צורך יכול לנוע בין נמוכה כמו 10 6 לרבים כמו 20 x 10 6 תאים, תלוי ברמת ביטוי חלבון. לדוגמה, lysate של HEK תאי overexpressing GFP-STAT3 הוכן על ידי טיפול בתאים שגודלו...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

ביטוי חלבון וטיהור הוא צעד מייגע ויקר, שהוא, לעומת זאת, יש צורך להגדרה של &quot;אינטראקציות K D על ידי שיטה הנפוצה ביותר כיום. יישום של MST מאפשר הימנעות טיהור חלבון ובכך לפשט באופן משמעותי ומאיץ אפיון כמותי של אינטראקציות. הוא מציג יתרונות משמעותיים במיוחד במקרה של ל...

אפיון כמותי של זיקה של אינטראקציות מולקולאריים חשוב בתחומים רבים של המחקר ביו. מחייבים ניתוק קבוע (K ד &#39;) הוא חיוני לא רק בגילוי סמים, אבל הוא גם פרמטר חשוב באפיון של כל אינטראקציה בינארי בכל מערכת ביולוגית. שיטות המשמשות לזיהוי ביוכימיים של אינטראקציות בין חלבונים, כגון immunoprecipitation ושמרי מסכי שני היברידיים, לא להודיע ​​לנו על כמה חזק הן אינטראקציות אלה, תוך זיקה מגדירה אם מורכב מסוים זה קיים בתנאים שניתנו in vivo. בתהליך גילוי תרופות, פיתוח assay מחייב הוא אחד ולעתים קרובות יש צורך בצעדים שדורשים זמן רב ביותר. שיטות נפוצות ביותר של נחישות D K כוללות קיטוב הקרינה, טכנולוגית 1 plasmon פני תהודה (SPR), 2 radioligand מחייב, 3 קלורימטריה טיטרציה איזוטרמי, 4 equilibriאום הדיאליזה (ED), 5 ultrafiltration (UF), 5 וultracentrifugation (UC). 6 כל אחד מהם דורשים כמויות משמעותיות של חלבון המטרה מטוהר. thermophoresis microscale (MST) הוא שיטה המתפתחת במהירות שמזהה תנועה בבימויו של מולקולות בשיפוע טמפרטורה מיקרוסקופית. כל שינוי של מעטפת הלחות של ביומולקולות תוצאה בשינוי יחסי של תנועה לאורך שיפוע הטמפרטורה. 7 MST משמש כדי לקבוע זיקות מחייבות ויושם ללימוד יגנד מחייב לחלבוני שכותרתו fluorescently או ligands ניאון לחלבון המטרה. 8, 9 MST מאפשר מדידה של אינטראקציות ישירות בפתרון ללא צורך בקיבוע למשטח (טכנולוגיה ללא קיבוע). למעשה, כל מחייב מלווה בשינוי בMST אות, אם כי גודלו של השינוי שונה ממערכת למערכת באופן משמעותי. לצורך זיהוי של תנועת מולקולה על ידי MST, הם צריכים להיות לזרוחNT. מגבלה העיקרית של השיטה זו ניתן להפוך ליתרון. אם חלבון מתבטא כהיתוך GFP בכל מערכת, זה יהיה רק ​​מולקולת ניאון ובכך ניתן ללמוד ללא בידוד ממערכת ביטוי חופשי תא lysate התא או. הדור של lysates התא המאפשרים תנאים מחייבים עם ממצאים מינימאליים הוא האתגר הגדול. כאן אנו מתארים פרוטוקול של הכנת תא lysate וניסוי MST שיכול לשמש להרבה חלבונים מסיסים וקרום. חלבוני STAT טמונים גורמי שעתוק cytoplasmic מופעלים על ידי זירחון טירוזין בתגובה לאותות תאיים, והם מעורבים בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל חסינות, hematopoiesis, דלקת, ופיתוח. -10 ביונקים, משפחת STAT מורכבת מ1 STAT, 2, 3, 4 , 5A, 5B, ו -6. כל הנתונים הסטטיסטיים המופעלים ידועים להיקשר לאותו רצף ה-DNA, שנקרא כך מוטיב גז, IFN-גמא הופעל רצף. עם זאת, transcriהשפעות ptional של נתונים סטטיסטיים שונות הן שונים מאוד. 11 למרות המעורבות בתהליכים פתולוגיים רבים ומחקרים מקיפים מניב מעל 17,000 פרסומים, D K של אינטראקציות STAT עם רצפי DNA שונים לא נקבע. רק זיקה היחסית של נתונים סטטיסטיים שונים לגרסות שונות של מוטיב גז התאפיינה. 11 קשיים בביטוי חלבון וטיהור הם המכשולים העיקריים באפיון של ה-DNA המחייב סלקטיביות &#39;הסטטיסטיקה. על אף שרוב המחקרים התמקדו בתפקידו של סטטיסטיקה &quot;מופעלת&quot;, שהפך לשם נרדף לגורם שעתוק Tyr-phosphorylated, התפקיד של נתונים סטטיסטיים שאינו phosphorylated (U-stats) ברגולציה של שעתוק מתגלה במהירות. 12 עם זאת, מנגנונים אלה הם הבינו היטב, ולא היה ברורים אם U-STATS ממש להיקשר לדנ&quot;א או לפעול באמצעות אינטראקציות עם גורמי שעתוק אחרים. הראנו לאחרונה כי U-STAT3 יכול להיקשר ל-DNA sequenיש CES שונה ממוטיבי גז עם זיקה גבוהה אף יותר. 13 הממצא השלכות משמעותיות על ההבנה של התפקודים הביולוגיים של חלבון חשוב זה שלנו. יש לנו ליישם thermophoresis microscale לקבוע זיקות יחסיות של STAT3 לגז ו-AT עשיר oligonucleotide S 100 (איור 4). פרוטוקול כמעט זהה שימש במשך נחישות D K עבור קשירה של ליגנד STAT3 שונה, מעכב lipopeptide. 14 לא מחייב לגורם שעתוק קשור, ה-GFP-STAT1 ששימש כביקורת שלילית ניתן היה לזהות וכך אישר את הסלקטיביות של אינטראקציה. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

אפיון כמותי של אינטראקציות חלבון חיוני כמעט בכל תחום של מדעי חיים, ובמיוחד גילוי סמים. רוב השיטות הקיימים כיום של נחישות D K דורשים גישה למטוהרי חלבון של עניין, דור אשר יכול להיות זמן רב ויקר. פיתחנו פרוטוקול המאפשר לקביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis microscale (MST) ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. השיטה כרוכה בביטוי יתר של החלבון ה-GFP, התמזגו ותמוגה תא שבאינו denaturing תנאים. יישום השיטה לSTAT3-GFP transiently מתבטא בתאי HEK293 אפשרו לקבוע בפעם הראשונה את הזיקה של גורם השעתוק למד היטב לoligonucleotides עם רצפים שונים. הפרוטוקול הוא פשוט, ויכול להיות מגוון רחב של יישומים לחקר אינטראקציות של חלבונים עם מולקולות קטנות, פפטידים, DNA, RNA, ו-proteins.

מדידת הזיקה של חלבון STAT3 הלא phosphorylated מחייב oligonucleotides. HEK293 תאים לבטא STAT3-GFP שמשו כמקור STAT3 כותרתו fluorescently לassay מחייב ה-DNA. lysates התא הוכן באמצעות Ripa חיץ (20x10 6 תאים / מ&quot;ל). ללימודים מחייבים, את lysates דוללו 150X עם חיץ ה-DNA מחייב MST ?...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

thermophoresis microscale (MST) יכול להיות בשימוש נרחב לקביעת זיקה מחייבת ללא טיהור של חלבון המטרה מlysates התא. הפרוטוקול כולל ביטוי יתר של החלבון ה-GFP-התמזגו, תמוגה תא שבאינו denaturing תנאים, וזיהוי של אות MST בנוכחות ריכוזים שונים של ליגנד.

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

הכינון ביוכימיים של קולטן סטרואידים • Hsp90 קומפלקסים חלבונים ו מחדש של ליגנד הכבילה

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

ניתוח בזמן אמת של תעבורת רטינול ידי הקולטן ממברנה של חלבון מחייב פלזמת רטינול

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...