Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

से तथा संघीय कोष, NCI और Calidris चिकित्सा विज्ञान के बीच सहयोगात्मक अनुसंधान समझौते, ओ.टी. के लिए अमेरिकन कैंसर सोसायटी अनुदान IRG 97-152-17 इस काम आंशिक रूप एनआईएच, राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, कैंसर रिसर्च के लिए केंद्र के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया अनुबंध HHSN26120080001E तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, एनआईएच,.

1. सेल lysate की तैयारी इस प्रोटोकॉल किसी भी GFP-जुड़े प्रोटीन व्यक्त पक्षपाती कोशिकाओं के लिए करना है. जरूरत सेल नंबर प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है, के रूप में कम के रूप में कई के रूप म?...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि, तथापि, सबसे वर्तमान में प्रयोग विधि से बातचीत &#39;कश्मीर डी के निर्धारण के लिए आवश्यक है जो एक कठिन और महंगा कदम है. टिकट के आवेदन काफी बातचीत की मात्रात्मक लक्षण वर्णन ?...

Intermolecular बातचीत की आत्मीयता के मात्रात्मक लक्षण वर्णन जैव चिकित्सा अनुसंधान के कई क्षेत्रों में महत्वपूर्ण है. बाइंडिंग लगातार कश्मीर (डी) हदबंदी न केवल दवाओं की खोज में आवश्यक है, लेकिन यह भी किसी भी जैविक प्रणाली में किसी भी बाइनरी बातचीत के लक्षण वर्णन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है. ऐसे immunoprecipitation और खमीर दो संकर स्क्रीन के रूप में प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का पता लगाने के लिए इस्तेमाल जैव रासायनिक विधियों, आत्मीयता यह विशेष रूप से जटिल विवो में दी गई शर्तों के तहत मौजूद है परिभाषित करता है, जबकि तंग कैसे वे बातचीत कर रहे हैं, हम पर सूचित नहीं करते. दवा की खोज की प्रक्रिया में, बंधन परख विकास जरूरी है और अक्सर सबसे अधिक समय लेने वाली कदमों में से एक है. कश्मीर डी दृढ़ संकल्प का सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, 1 सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) प्रौद्योगिकी, 2 radioligand बंधन, 3 इज़ोटेर्माल अनुमापन उष्मामिति, 4 equilibri शामिलउम डायलिसिस (ईडी), 5 ultrafiltration (यूएफ), 5 और ultracentrifugation (यूसी). 6 उनमें से सभी लक्ष्य प्रोटीन शुद्ध के महत्वपूर्ण मात्रा की आवश्यकता होती है. Microscale thermophoresis (MST) एक सूक्ष्म तापमान ढाल में अणुओं का निर्देशन किया आंदोलन का पता लगाता है कि एक तेजी से विकसित विधि है. तापमान ढाल के साथ आंदोलन के एक रिश्तेदार परिवर्तन में biomolecules के परिणाम की जलयोजन खोल के किसी भी बदल जाता है. 7 MST बाध्यकारी समानताएं निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और एक लक्ष्य प्रोटीन को fluorescently लेबल प्रोटीन या फ्लोरोसेंट ligands के लिए बाध्य ligand के अध्ययन के लिए लागू किया गया है. 8, 9 MST एक सतह को स्थिरीकरण की जरूरत है (स्थिरीकरण मुक्त प्रौद्योगिकी) के बिना सीधे समाधान में बातचीत की माप की अनुमति देता है. परिवर्तन का आकार काफी प्रणाली से व्यवस्था करने के लिए अलग है, हालांकि व्यावहारिक रूप से, किसी भी बंधन, MST संकेत में एक परिवर्तन के साथ है. MST द्वारा अणु गति का पता लगाने के लिए, वे प्रतिदीप्ति होना हैNT के. विधि का यह प्रमुख सीमा एक लाभ में तब्दील किया जा सकता है. एक प्रोटीन किसी भी प्रणाली में एक GFP संलयन के रूप में व्यक्त किया जाता है, यह केवल फ्लोरोसेंट अणु हो सकता है और इस प्रकार सेल lysate या सेल मुक्त अभिव्यक्ति प्रणाली से अलगाव के बिना अध्ययन किया जा सकता है. न्यूनतम कलाकृतियों के साथ बंधन स्थितियों के लिए अनुमति देते हैं कि सेल lysates की पीढ़ी बड़ी चुनौती है. यहाँ हम कई घुलनशील और झिल्ली प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि सेल lysate तैयारी और टिकट प्रयोग के एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. स्टेट प्रोटीन कोशिकी संकेतों के जवाब में टाइरोसीन फास्फोरिलीकरण से सक्रिय साइटोप्लाज्मिक प्रतिलेखन कारक अव्यक्त रहे हैं और प्रतिरक्षा, hematopoiesis, सूजन, और विकास. स्तनधारियों में 10 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में शामिल हैं, स्टेट परिवार स्टेट 1, 2, 3, 4 के होते हैं , 5A, 5 ब, और 6. सभी सक्रिय आँकड़े ही डीएनए अनुक्रम करने के लिए बाध्य करने के लिए जाना जाता है, ताकि गैस मूल भाव कहा जाता है, IFN-गामा अनुक्रम सक्रिय. हालांकि, transcriअलग आँकड़े के वैकल्पिक प्रभाव बहुत अलग हैं. 11 कई रोग प्रक्रियाओं और 17,000 प्रकाशनों से अधिक उपज व्यापक अध्ययन में शामिल होने के बावजूद, अलग डीएनए दृश्यों के साथ स्टेट बातचीत से कश्मीर डी निर्धारित नहीं किया गया है. गैस आकृति की वेरिएंट के लिए अलग आँकड़े के ही रिश्तेदार समानता होती है. प्रोटीन अभिव्यक्ति और शोधन में 11 कठिनाइयाँ आँकड़े &#39;डीएनए बाध्यकारी चयनात्मकता के लक्षण वर्णन में प्रमुख बाधाओं रहे हैं. पढ़ाई के बहुमत Tyr-phosphorylated प्रतिलेखन कारक के पर्याय बन गया है जो &quot;सक्रिय&quot; आँकड़े,, प्रतिलेखन के नियमन में गैर phosphorylated आँकड़े (यू आँकड़े) की भूमिका की भूमिका पर ध्यान केंद्रित किया है हालांकि तेजी से उभर रहा है. 12 हालांकि, इन तंत्र खराब समझ, और इसे यू आँकड़े वास्तव में डीएनए के लिए बाध्य या अन्य प्रतिलेखन कारकों के साथ बातचीत के माध्यम से कार्य स्पष्ट नहीं था कि कर रहे हैं. हमने हाल ही में यू STAT3 डीएनए sequen करने के लिए बाध्य कर सकते हैं कि पता चला हैयहां तक कि उच्च आत्मीयता के साथ गैस रूपांकनों से अलग CES. 13 निष्कर्ष इस महत्वपूर्ण प्रोटीन की जैविक कार्यों के बारे में हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. हम गैस STAT3 के रिश्तेदार समानताएं निर्धारित करने के लिए microscale thermophoresis लागू है और एटी युक्त oligonucleotide एस 100 (चित्रा 4) है. लगभग समान प्रोटोकॉल एक अलग STAT3 ligand, एक lipopeptide अवरोध के बंधन के लिए कश्मीर डी निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया है. 14 एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि एक संबंधित प्रतिलेखन कारक, GFP-STAT1 के लिए बाध्य नहीं है इस तरह की बातचीत के चयनात्मकता की पुष्टि का पता लगाया जा सकता है. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

प्रोटीन बातचीत के मात्रात्मक लक्षण वर्णन विशेष रूप से जीवन विज्ञान, दवाओं की खोज की व्यावहारिक रूप से किसी भी क्षेत्र में आवश्यक है. कश्मीर डी दृढ़ संकल्प के वर्तमान में उपलब्ध तरीकों का सबसे अधिक समय लेने वाली और महंगा हो सकता पीढ़ी जिनमें से ब्याज की प्रोटीन, शुद्ध करने के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है. हम सेल lysates से लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि के बिना microscale thermophoresis (MST) द्वारा बंधन आत्मीयता के निर्धारण के लिए अनुमति देता है एक प्रोटोकॉल विकसित किया है. विधि गैर denaturing परिस्थितियों में GFP जुड़े प्रोटीन और सेल की overexpression शामिल है. STAT3-GFP के लिए विधि के आवेदन क्षणिक पहली बार विभिन्न दृश्यों के साथ oligonucleotides के लिए अच्छी तरह से अध्ययन प्रतिलेखन कारक के आकर्षण के लिए निर्धारित करने के लिए अनुमति दी HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त किया. प्रोटोकॉल सरल है और छोटे अणुओं, पेप्टाइड्स, डीएनए, आरएनए के साथ प्रोटीन की बातचीत का अध्ययन करने के लिए आवेदन की एक किस्म है सकते हैं, और पीroteins.

Oligonucleotides के लिए बाध्य गैर phosphorylated STAT3 प्रोटीन की आत्मीयता मापने. STAT3-GFP व्यक्त HEK293 कोशिकाओं के डीएनए बाध्यकारी परख के लिए fluorescently लेबल STAT3 के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया. सेल lysates RIPA बफर (20x10 6...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microscale thermophoresis (MST) व्यापक रूप से सेल lysates से लक्ष्य प्रोटीन की शुद्धि के बिना बंधन आत्मीयता के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल GFP-जुड़े प्रोटीन, गैर denaturing परिस्थितियों में सेल, और ligand के अलग सांद्रता की उपस्थिति में MST संकेत का पता लगाने की overexpression शामिल है.

Microscale Thermophoresis द्वारा बंधन आत्मीयता निर्धारण के प्रोटीन शुद्धीकरण मुक्त विधि

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume प्रोटीन एकाग्रता निर्धारण का उपयोग NanoDrop 2000C स्पेक्ट्रोफोटोमीटर

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

कैनेटीक्स और संरचना समारोह विश्लेषण में आत्मीयता निर्धारण के लिए सही प्रोटीन एकाग्रता का महत्व

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

अस्थिर मल्टी प्रोटीन परिसर के अलगाव द्वारा Vivo में नियंत्रित पार से जोड़ने और इम्यूनो - चुंबकीय आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी सेलुलर

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

बराबर क्लिप - एक विधि transcriptome चौड़ा शाही सेना बंधनकारी प्रोटीन की बाइंडिंग साइटें पहचानें

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

लिपिड आत्मीयता पुटिका की मध्यस्थता चुंबकीय सक्रिय सेल छंटनी (LIMACS) का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी: प्रोटीन लिपिड इंटरेक्शन विश्लेषण के लिए एक उपन्यास विधि

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

स्टेरॉयड रिसेप्टर की बायोकेमिकल पुनर्गठन • HSP90 प्रोटीन ligand के परिसर और पुनर्सक्रियण बंधन

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

विषयेतर प्रोटीन एक लघु bispecific आत्मीयता टैग द्वारा सुविधा शोधन

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

प्रोटीन बातचीत मिलकर आत्मीयता शोधन का उपयोग पार्टनर्स की पहचान

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

प्लाज्मा Retinol बाइंडिंग प्रोटीन की झिल्ली रिसेप्टर द्वारा वास्तविक समय Retinol परिवहन का विश्लेषण

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

पुनः संयोजक प्रोटीन फँसाना चाहे का उपयोग फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन के लिए एक प्रोटोकॉल

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...