Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Cancer Institute, Centro per la Ricerca sul Cancro; accordo di collaborazione di ricerca tra NSC e Calidris Therapeutics, American Cancer Society concessione IRG 97-152-17 di OT, e fondi federali dal National Cancer Institute, NIH, sotto HHSN26120080001E contratto.

1. Preparazione del lisato Questo protocollo è destinato cellule aderenti esprimono alcuna proteina GFP-fusa. Numero di cellule necessarie possono variare da un minimo di 10 6 di ben 20 x 10 6 cellule, a seconda del livello di espressione della proteina. Per esempio, lisato di cellule HEK overexpressing GFP-STAT3 è stato preparato trattando cellule coltivate in fiasche T75 10 vicino al 70% di confluenza con 1 ml di tampone di lisi. Tuttavia, questo lisato stati diluiti ...

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Espressione e purificazione di proteine ​​è un passo laboriosa e costosa, che è, tuttavia, necessario per la determinazione delle interazioni &#39;K D dal metodo più usato. Applicazione del MST permette di evitare la purificazione di proteine ​​così in modo significativo semplificare ed accelerare la caratterizzazione quantitativa delle interazioni. Esso presenta vantaggi particolarmente significativo nel caso di-to-esprimere difficili e purificare proteine, quali le proteine ​​di membrana e f...

Caratterizzazione quantitativa di affinità di interazioni intermolecolari è importante in molti settori della ricerca biomedica. Legame costante di dissociazione (K D) è essenziale non solo nella scoperta della droga, ma è anche un parametro importante caratterizzazione di ogni interazione binaria in qualsiasi sistema biologico. Metodi biochimici utilizzati per il rilevamento di interazioni proteina-proteina, come la immunoprecipitazione e lievito schermi a due ibridi, non ci informano su quanto stretto sono quelle interazioni, mentre affinità definisce se questo particolare complesso esiste in determinate condizioni in vivo. Nel processo di scoperta di nuovi farmaci, lo sviluppo del saggio di legame è uno dei più necessaria e spesso i passi più in termini di tempo. Metodi più utilizzati per la determinazione K D includono polarizzazione di fluorescenza, 1 tecnologia risonanza plasmonica di superficie (SPR), vincolante radioligando 2, 3 isotermica di titolazione calorimetria, 4 Equilibrium dialisi (ED), 5 ultrafiltrazione (UF), 5 e ultracentrifugazione (UC). 6 Tutte richiedono notevoli quantità di proteina purificata bersaglio. Thermophoresis microscala (MST) è un metodo rapido sviluppo che rileva la regia movimento delle molecole in un gradiente di temperatura microscopico. Eventuali modifiche del guscio di idratazione biomolecole comportano un cambiamento relativo di movimento lungo il gradiente di temperatura. 7 MST viene utilizzato per determinare affinità di legame ed è stato applicato per lo studio legame alle proteine ​​fluorescente o ligandi fluorescenti ligando ad una proteina bersaglio. 8, 9 MST consente di misurare direttamente interazioni in soluzione, senza la necessità di immobilizzazione di una superficie (immobilizzazione tecnologia senza). Praticamente, qualsiasi associazione è accompagnato da un cambiamento nel segnale MST, anche se la dimensione del cambiamento differisce da sistema a sistema in modo significativo. Per la rilevazione di movimento molecola da MST, devono essere fluorescenzant. Questo importante limitazione del metodo può essere trasformato in un vantaggio. Se una proteina è espressa come una fusione GFP in qualsiasi sistema, sarà la sola molecola fluorescente e quindi può essere studiata senza separazione dal lisato cellulare o sistema di espressione acellulare. Generazione di lisati cellulari che permettono di condizioni vincolanti con manufatti minimali è la grande sfida. Qui si descrive un protocollo di cellule lisate e sperimentare MST che può essere utilizzato per molte proteine ​​solubili e di membrana. Proteine ​​STAT sono latenti fattori di trascrizione attivati ​​da citoplasmatici fosforilazione della tirosina in risposta a segnali extracellulari e sono coinvolti in molti processi biologici tra immunità, ematopoiesi, infiammazione e sviluppo. 10 Nei mammiferi, la famiglia STAT costituito STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. All Stats attivati ​​sono noti per legarsi alla stessa sequenza di DNA, così chiamato motivi GAS, IFN-gamma attivato sequenza. Tuttavia, la transcrieffetti facoltativo, di diverse statistiche sono molto diversi. 11 Nonostante il coinvolgimento in molti processi patologici e ampi studi che producono oltre 17.000 pubblicazioni, la K D di interazioni STAT con diverse sequenze di DNA non sono stati determinati. Solo affinità relativa delle diverse statistiche varianti del motivo GAS è stato caratterizzato. 11 Difficoltà di espressione e purificazione di proteine ​​sono i principali ostacoli nella caratterizzazione di STAT &#39;DNA selettività vincolante. Anche se la maggior parte degli studi si sono concentrati sul ruolo delle stats &quot;attivato&quot;, che divenne sinonimo di fattore di trascrizione Tyr-fosforilata, il ruolo del non-fosforilata Stats (U-stats) nella regolazione della trascrizione sta emergendo rapidamente. 12 Tuttavia, questi meccanismi sono poco conosciute, e non era chiaro se U-stats in realtà si legano al DNA o di agire attraverso le interazioni con altri fattori di trascrizione. Abbiamo recentemente dimostrato che l&#39;U-STAT3 può legarsi al DNA sequenzialeCES diverso da motivi a gas con ancora maggiore affinità. 13 La scoperta ha implicazioni significative per la nostra comprensione delle funzioni biologiche di questa importante proteina. Abbiamo applicato thermophoresis microscala per determinare affinità relative di STAT3 a GAS e AT-ricco oligonucleotide S 100 (Figura 4). Protocollo pressoché identico è stato utilizzato per la determinazione K D per il legame di un ligando diverso STAT3, un inibitore lipopeptide. 14 N. vincolante per un fattore di trascrizione correlato, GFP-STAT1 che è stato utilizzato come controllo negativo si poteva individuare confermando selettività di interazione. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caratterizzazione quantitativa delle interazioni della proteina è essenziale in praticamente ogni campo delle scienze della vita, in particolare di scoperta di nuovi farmaci. La maggior parte dei metodi attualmente disponibili di determinazione K D richiedono accesso purificata proteina di interesse, di generazione che può essere lunga e costosa. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente di determinare l&#39;affinità di legame per thermophoresis microscala (MST) senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il metodo prevede sovraespressione della proteina GFP-fuso e lisi cellulare in condizioni non denaturanti. Applicazione del metodo di STAT3-GFP espresso transitoriamente in cellule HEK293 permesso di determinare per la prima volta l&#39;affinità del fattore di trascrizione ben studiato per oligonucleotidi con sequenze differenti. Il protocollo è semplice e può avere una varietà di applicazione per studiare le interazioni delle proteine ​​con piccole molecole, peptidi, DNA, RNA, e proteins.

Misurando l&#39;affinità di non fosforilata STAT3 legame proteico oligonucleotidi. Cellule HEK293 esprimenti STAT3-GFP sono stati utilizzati come fonte di fluorescente STAT3 per saggio di legame al DNA. I lisati cellulari sono stati preparati usando tampone RIPA (20x10 6 cellule / ml). Per studi di legame, i lisati sono stati diluiti con 150x MST tampone di legame al DNA per fornire il livello ottimale della proteina fluorescente nella reazione di legame (circa 20 n...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Thermophoresis microscala (MST) può essere ampiamente usato per la determinazione di affinità di legame senza purificazione della proteina bersaglio da lisati cellulari. Il protocollo prevede sovraespressione della proteina GFP-fusa, lisi cellulare in condizioni non denaturanti, e la rilevazione di segnale MST in presenza di concentrazioni variabili di ligando.

Protein Purification-libera Metodo di Binding Affinity Determinazione Thermophoresis microscala

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

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