Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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からとフェデラル·ファンド; NCIとCalidrisピュー間共同研究契約、; OTに米国癌協会助成IRG 97-152-17この作品は、部分的にNIH、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました契約HHSN26120080001E下の国立がん研究所、NIH、。

1。細胞溶解物の準備このプロトコルは、任意のGFP融合タンパク質を発現する接着細胞を対象としています。必要とされる細胞数は、低タンパク質発現のレベルに応じて、最大20×10 6細胞〜6 10とで変えることができる。例えば、HEK細胞を過剰発現するGFP-STAT3の溶解物を、1mlの溶解緩衝液で70％コンフルエントに近い10 T75フラスコ中で培養した細胞を処理する...

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	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

タンパク質の発現および精製は、しかし、ほとんどの現在使用されている方法により相互作用&#39;K Dを決定するために必要な労力を要しかつ高価な工程である。 MSTの適用が大幅に相互作用の定量的な特性評価を簡素化し、加速するため、タンパク質精製を避けることができます。このような膜タンパク質及び転写因子などの困難な発現及び精製タンパク質の場合に特に顕著な利点を?...

分子間相互作用の親和性の定量的特性評価は、生物医学研究の多くの分野において重要である。結合定数（K D）解離だけでなく、創薬に不可欠であるだけでなく、任意の生物学的システム内の任意のバイナリの相互作用の特性評価に重要なパラメータである。このような免疫沈降および酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのタンパク質-タンパク質相互作用の検出のために使用生化学的方法では、親和性は、この特定の複合体が、生体内で与えられた条件の下に存在するかどうかを定義しながら、それらの相互作用は、どのように締まっている私たちを上に通知していない。創薬プロセスにおいては、結合アッセイの開発が必要と頻繁に最も時間のかかる工程の一つである。 K D判定の最も一般的に使用される方法は、蛍光偏光、1表面プラズモン共鳴（SPR）技術、2放射性リガンド結合、3等温滴定熱量測定、4 equilibriを含むウム透析（ED）、5限外濾過（UF）、5及び超遠心分離（UC）6は、それらのすべては、標的タンパク質の精製かなりの量を必要とする。マイクロスケール熱泳動（MST）は、微視的温度勾配​​中の分子の指示動きを検出急速に発展方式です。温度勾配に沿った移動の相対的な変化で生体分子結果の水和殻のいずれかに変化する。7 MSTが結合親和性を決定するために使用され、蛍光標識したタンパク質または標的タンパク質の蛍光リガンドに結合するリガンドの研究に適用されている。8、 9 MSTは表面への固定化の必要性（固定フリー技術）せずに直接溶液中での相互作用の測定が可能。変化の大きさが大きく、システムによって異なるが、実質的に、任意の結合は、MST信号の変化を伴っている。 MSTによる分子の動きの検出のために、彼らが蛍光を発するしなければならないNT。このメソッドの主な制限は、利点に変換することができます。タンパク質は、任意のシステムにおけるGFP融合体として発現される場合、それは唯一の蛍光分子となり、従って、細胞溶解物又は無細胞発現系から単離することなく研究することができる。最小限のアーティファクトとの結合条件を可能に細胞溶解物の生成は、大きな課題です。ここでは、多くの可溶性および膜タンパク質を使用することができ、細胞溶解物の準備とMST実験のプロトコルを記述します。 STATタンパク質は、細胞外シグナルに応答してチロシンリン酸化により活性化細胞転写因子の潜在していると免疫、造血、炎症、および開発を含む多くの生物学的過程に関与している。哺乳類で10、STATファミリーは、STAT 1、2、3、4から成り、5A、5B、及び図6。すべてのアクティブ統計をIFN-γ活性化するシーケンスので、GASモチーフと呼ばれる、同じDNA配列に結合することが知られている。しかし、transcriSTATは異なるのptional効果は非常に異なっています。関与にもかかわらず、11種類のDNA配列と17,000出版、STAT相互作用のK Dにわたってもたらす多くの病理学的プロセスと広範な研究で決定されていない。ガスのみモチーフの変種に異なるSTATはの相対親和性が特徴づけられている。タンパク質の発現と精製11難しさは、STATS &#39;DNA結合選択性の特性評価における主要な障害である。研究の大半はTyrのリン酸化転写因子への代名詞となった&quot;活性化&quot; STATは、転写の調節に非リン酸化STATは（U-STATS）の役割の役割に焦点を当ててきたが、急速に浮上している12は、しかし、これらのメカニズムは十分に理解され、それがU-STATSは、実際に他の転写因子との相互作用を介してDNAまたは行為にバインドするかどうかは不明であったされています。我々は最近、U-STAT3がDNA sequenに結合することができることが示されているさらに高い親和性を有するガスモチーフ異なるCES 13は、発見は、この重要なタンパク質の生物学的機能の理解のために重要な意味を持っています。我々はガスにし、オリゴヌクレオチドS +100（ 図4）豊富なAT STAT3の相対的な親和性を決定するために、マイクロ熱泳動を適用している。陰性対照として用いた関連転写因子、GFP-STAT1とほぼ同一のプロトコルが異なるSTAT3リガンド、リポペプチド阻害剤の結合のためのK Dを決定するために使用されている。14結合はこのような相互作用の選択性を確認した検出することができなかった。 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

タンパク質相互作用の定量的特性評価、特に生命科学、創薬の実質的にすべての分野で必要不可欠である。 K D判定の現在利用可能な方法のほとんどは、時間がかかり、高価である生成うち目的のタンパク質を精製へのアクセスを必要とする。我々は、細胞溶解物から標的タンパク質の精製をせずにマイクロ熱泳動（MST）による結合親和性の決定を可能にするプロトコルを開発した。この方法は、非変性条件下でのGFP融合タンパク質および細胞溶解の過剰発現を伴う。 STAT3-GFPへの法の適用は、一過性に初めて異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによく研究転写因子の親和性を決定するために許可されたHEK293細胞で発現。プロトコルは、簡単であり、小分子、ペプチド、DNA、RNAとタンパク質の相互作用を研究するための、アプリケーションの様々な構造を有することができ、及びproteins。

オリゴヌクレオチドに結合非リン酸化STAT3タンパク質の親和性を測定する。 STAT3-GFPを発現するHEK293細胞を、DNA結合アッセイのために蛍光標識されたSTAT3の供給源として使用した。細胞溶解物をRIPA緩衝液（20×10 6細胞/ ml）を用いて調製した。結合研究のために、溶解物を結合反応（約20nM）の蛍光タンパク質の最適なレベルを提供するようにMST-DNA結合緩?...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

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不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

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Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

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磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

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Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

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タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

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Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...