Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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에서 연방 기금, NCI와 도요 치료학 사이의 공동 연구 계약; OT에 미국 암 협회 기금 IRG 97-152-17이 작품은 부분적으로 NIH, 국립 암 연구소, 암 연구 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다 계약 HHSN26120080001E에 따라 국립 암 연구소, NIH.

1. 셀 해물의 준비 이 프로토콜은 모든 GFP 융합 단백질을 발현하는 세포 부착을위한 것입니다. 필요한 세포 수, 단백질 발현 수준에 따라 최저 많은 20의 x 10 6 세포 6 10에서 다를 수 있습니다. 예를 들어, HEK 세포에 과발현 GFP-STAT3의 해물는 1 ML의 용해 버퍼와 70 %에 가까운 자랄 때 10 ~ T75 플라스크에서 자란 세포를 처리하여 제조 하였다. 그러나이 해물는 MST의 실...

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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

단백질 발현 및 정제는, 그러나, 대부분의 현재 사용되는 방법으로 상호 작용 &#39;K D의 결정에 필요한 노동력 및 비용 단계입니다. MST의 응용 프로그램은 크게 상호 작용의 정량적 특성을 단순화하고 가속화함으로써 단백질 정제를 방지 할 수 있습니다. 그런 막 단백질과 전사 인자로하기 어려운 표현하고 정화 단백질의 경우 특히 중요한 이점을 제공합니다. MST의 주...

분자간 상호 작용의 유사성의 양적 특성은 생물 의학 연구의 많은 분야에서 중요합니다. 결합 상수 (K D) 해리뿐만 아니라 신약 개발에 필수적인뿐만 아니라 모든 생물 시스템의 모든 바이너리 상호 작용의 특성에 중요한 매개 변수입니다. 이러한 면역 침전 효모 두 하이브리드 화면 등의 단백질 - 단백질 상호 작용의 검출에 사용되는 생화학 적 방법은 궁합이 특정 복잡한 생체 내에서 주어진 조건에 따라 존재 여부를 정의하는 동안 얼마나 긴밀한 이러한 상호 작용이있다 우리에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 약물 발견 과정에서 바인딩 분석 개발이 필요하고 자주 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나입니다. K D 결정의 가장 일반적으로 사용되는 방법은 형광 편광, 1 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술이 방사성 바인딩, 3 등온 적정 열량계, 4 equilibri을 포함음 투석 (ED), 5 한외 여과 (UF), 5 원심 (UC). 6 그들 모두는 표적 단백질을 정제 상당한 양을 필요로합니다. 마이크로 thermophoresis (MST)은 미세한 온도 변화에서 분자의 방향 움직임을 감지 급속히 발전 방법입니다. 온도 변화에 따라 운동의 상대적인 변화에 생체 분자 결과의 수화 쉘의 변경 7. MST는 바인딩 친화력을 결정하는 데 사용되며 타겟 단백질에 형광 표지 단백질이나 형광등 리간드에 결합 리간드를 공부 적용되었습니다. 8 9 MST는 표면에 고정화의 필요 (고정 - 자유 기술)하지 않고 직접 솔루션의 상호 작용을 측정 할 수 있습니다. 변화의 크기가 크게 시스템에 따라 차이가 있지만 거의 모든 바인딩은, MST 신호의 변화에​​ 의해 동반됩니다. MST에 의한 분자 운동의 탐지를 위해, 그들은 형광해야NT. 방법이 주요 제한은 장점으로 전환 할 수 있습니다. 단백질은 모든 시스템에서 GFP 융합으로 표현되는 경우에만 형광 분자되며 따라서 세포 파쇄 또는 세포 표현의 자유 시스템에서 분리하지 않고 공부하실 수 있습니다. 최소한의 아티팩트 바인딩 상태를 허용 세포 용 해물의 생성은 중요한 과제입니다. 여기에서 우리는 많은 수용성 및 막 단백질에 사용할 수있는 세포 lysate를 준비하고 MST 실험의 프로토콜을 설명합니다. STAT 단백질은 세포 외 신호에 대한 응답으로 티로신 인산화에 의해 활성화 세포질 전사 요인을 잠재하고 면역, 조혈, 염증, 개발. 포유류의 10을 (를) 포함하여 많은 생물 학적 과정에 관여하는, STAT 가족은 STAT 1, 2, 3, 4로 구성 , 5A, 5B, 6. 활성화 된 모든 통계가 같은 DNA 서열에 결합하는 것으로 알려져 있습니다, 그래서 가스 모티브라고, IFN-γ 시퀀스를 활성화. 그러나 transcri다른 통계의 ptional 영향이 매우 다릅니다. 11 많은 병적 인 과정 및 17,000 출판물에 항복 광범위한 연구에 참여에도 불구하고, 서로 다른 DNA 시퀀스와 STAT 상호 작용의 K D가 결정되지 않았습니다. 가스 모티프의 변형에 대한 다양한 통계 만 상대적으로 선호도가 특징되었습니다. 단백질 발현 및 정제 11 어려움이 통계 &#39;DNA 결합 선택도 특성의 주요 방해물이다. 연구의 대부분은 티르 인산화 전사 인자에 대명사 &quot;활성화&quot;통계, 전사 조절에 비 인산화 통계 (U-통계)의 역할의 역할에 초점을 맞추고 있지만 급속히 부상하고있다. 12 그러나 이러한 메커니즘을 제대로 이해, 그리고 U-통계가 실제로 DNA에 결합 또는 다른 전사 인자와의 상호 작용을 통해 작동하는지 불분명합니다. 우리는 최근 U-STAT3는 DNA 순차적에 바인딩 할 수있는 것으로 나타났습니다더 높은 친화력을 가진 가스 모티브 다른 CES. 13 발견이 중요한 단백질의 생물학적 기능에 대한 우리의 이해에 상당한 영향을 미칠 수있다. 우리는 가스에 STAT3의 상대적 유사성을 결정하는 마이크로 thermophoresis을 적용 AT 풍부한 올리고 뉴클레오티드 S +100 (그림 4)가있다. 거의 동일한 프로토콜은 다른 STAT3 리간드 lipopeptide 억제제의 바인딩 K D 결정에 사용되지 않았습니다. 14 음성 대조군으로 사용 된 관련 전사 인자, GFP-STAT1에 바인딩 없음은 따라서 상호 작용의 선택성을 확인 감지 할 수 있습니다. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

단백질 상호 작용의 양적 특성은 특히 생명 과학, 신약 개발의 거의 모든 분야에서 필수적이다. K D 결정의 현재 사용 가능한 대부분의 방법은 시간과 비용이 많이 소모 될 수 있습니다 발생하는이자의 단백질을 정제에 대한 액세스를 필요로합니다. 우리는 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 마이크로 thermophoresis (MST)에 의한 결합력 결정을 허용하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법은 비 변성 조건에서 GFP 융합 단백질 및 세포 용해의 발현을 포함한다. STAT3-GFP의 방법의 응용 프로그램이 일시적 처음으로 다른 시퀀스 올리고 뉴클레오티드를 잘 공부 전사 인자의 유사성을 판별 할 수 HEK293 세포에서 발현. 프로토콜은 간단하고 작은 분자, 펩티드, DNA, RNA와 단백질의 상호 작용을 공부 응용 프로그램의 다양한있을 수 있습니다, 및 Proteins.

올리고 뉴클레오티드에 바인딩 비 인산화 STAT3 단백질의 유사성을 측정합니다. STAT3-GFP를 발현 HEK293 세포는 DNA 결합 분석을위한 찬란 STAT3의 소스로 사용 하였다. 세포 용 해물은 RIPA 버퍼를 (20 × 10 6 세포 / ㎖)를 사용하여 제조 하였다. 결합 연구를 위해, 해물는 결합 반응 (20 NM)에서 형광 단백질의 최적 수준을 제공하기 위해 MST DNA-결합 버퍼 150X 희석 하였?...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

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