Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis støttet av egenutført Research Program av NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, Collaborative Research Avtale mellom NCI og Calidris Therapeutics, American Cancer Society stipend IRG 97-152-17 til OT, og føderale midler fra National Cancer Institute, NIH, under kontrakt HHSN26120080001E.

En. Utarbeidelse av Cell Lysate Denne protokollen er ment for heftende celler uttrykker noe GFP-smeltet protein. Nødvendig celle nummer kan variere fra så lavt som 10 6 til så mange som 20 x 10 6 celler, avhengig av nivået av protein uttrykk. For eksempel ble lysat av HEK-celler overekspresjon GFP-STAT3 fremstilt ved behandling av celler dyrket i 10 T75 kolber til tilnærmet 70% konfluens med 1 ml lysebuffer. Men hadde denne lysatet å bli utvannet 150 ganger for å g...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Proteinekspresjon og rensing er en arbeidskrevende og kostbar steg, som er imidlertid nødvendig for bestemmelse av interaksjoner &#39;K D ved de for tiden brukte metode. Anvendelsen av MST tillater unngå protein rensing dermed vesentlig forenkling og akselererende kvantitativ karakterisering av interaksjoner. Den presenterer spesielt betydelige fordeler når det gjelder vanskelige å uttrykke og rense proteiner, slik som membranproteiner og transkripsjonsfaktorer. Den største b...

Kvantitativ karakterisering av affinitet av intermolekylære interaksjoner er viktig på mange områder innen biomedisinsk forskning. Binding dissosiasjonskonstant (KD) er viktig, ikke bare i medisiner, men er også en viktig parameter for karakterisering av en hvilken som helst binær interaksjon i ethvert biologisk system. Biokjemiske metoder som brukes for påvisning av protein-protein interaksjoner, for eksempel immunoprecipitation og gjær to-hybrid skjermer, ikke informere oss om hvor tett er de interaksjoner, mens affinitet definerer om dette komplekset finnes under gitte forhold in vivo. I medisiner prosess, er bindingsprøve utvikling en av de nødvendige og som oftest er mest tidkrevende trinn. Mest brukte metodene for K D besluttsomhet inkluderer fluorescens polarisering, en overflate plasmonresonans (SPR)-teknologi, to radioligand bindende, 3 isoterm titrering kalorimetri, 4 equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltrering (UF), 5 og ultrasentrifugering (UC). 6. Alle krever betydelige mengder av renset målprotein. Mikroskala Thermophoresis (MST) er en rask utvikling metode som oppdager rettet bevegelse av molekyler i en mikroskopisk temperatur gradient. Eventuelle endringer av hydrering skallet av biomolekyler resulterer i en forandring av relativ bevegelse langs temperaturgradienten. MST 7 blir brukt til å bestemme bindingsaffiniteter og har blitt anvendt for å studere ligandbinding til fluorescensmerkede fluorescerende proteiner eller ligander til et målprotein, 8. 9 MST tillater måling av interaksjoner direkte i oppløsning uten behov for immobilisering til en overflate (immobilisering-fri-teknologi). Praktisk talt er enhver binding ledsaget av en endring i MST-signal, selv om størrelsen på endringen er forskjellig fra system til system betydelig. For påvisning av molekyl bevegelse av MST, må de være fluorescent. Denne store begrensning av metoden kan gjøres om til en fordel. Hvis et protein er uttrykt som en fusjon GFP i hvilket som helst system, vil det være den eneste fluorescerende molekyl og kan således studeres uten isolering fra cellelysat eller cellefritt ekspresjonssystem. Generasjon av cellelysater som gir mulighet for forpliktende forhold med minimale gjenstander er den store utfordringen. Her beskriver vi en protokoll av cellelysat forberedelse og MST eksperiment som kan brukes for mange oppløselige og membranproteiner. STAT proteiner er latente cytoplasmatiske transkripsjonsfaktorer som er aktivert av tyrosin-fosforylering som respons på ekstracellulære signaler, og er involvert i mange biologiske prosesser, inkludert immunitet, hematopoiesis, betennelse og utvikling. 10. I pattedyr, består av STAT-familien av en STAT, 2, 3, 4 , 5A, 5B og 6. Alle aktiverte statistikk er kjent for å binde til den samme DNA-sekvensen, såkalte GAS motiv, IFN-y aktivert sekvens. Imidlertid transcriptional effekter av ulike statistikker er svært forskjellige. 11. Til tross for involvering i mange patologiske prosesser og omfattende studier ettergivende over 17.000 publikasjoner, har K D av STAT interaksjoner med ulike DNA-sekvenser ikke fastslått. Bare relative affinitet for ulike Stats til varianter av GAS motiv har vært preget. 11. Vanskeligheter med protein uttrykk og rensing er de store hindringer i karakterisering av Stats &#39;DNA bindende selektivitet. Selv om de fleste av studiene har fokusert på rollen som &quot;aktivert&quot; statistikk, som ble synonymt med Tyr-fosforylert transkripsjonsfaktor, rollen av ikke-fosforylert Stats (U-stats) i regulering av transkripsjon fremstår raskt. 12. Men disse mekanismene er dårlig forstått, og det var uklart om U-Stats faktisk binder seg til DNA eller handle gjennom interaksjon med andre transkripsjonsfaktorer. Vi har nylig vist at U-STAT3 kan binde seg til DNA SequentialCES forskjellig fra GAS motiver med enda høyere affinitet. 13. Funnene har betydelige implikasjoner for vår forståelse av de biologiske funksjonene i denne viktige protein. Vi har søkt mikroskala Thermophoresis å bestemme relative slektskap STAT3 til GAS og AT-rik oligonucleotide S 100 (figur 4). Nesten identisk protokoll har vært brukt i K D bestemmelse for binding av en forskjellig STAT3 ligand, et lipopeptid-inhibitor. 14. Ingen binding til et beslektet transkripsjonsfaktor, GFP-STAT1 som ble brukt som en negativ kontroll kunne det ikke påvises noe som bekrefter selektivitet for interaksjon. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Kvantitativ karakterisering av protein interaksjoner er viktig i praktisk talt alle felt av biovitenskap, spesielt drug discovery. Mesteparten av tiden tilgjengelig metoder for K D besluttsomhet krever tilgang til renset protein av interesse, generering av noe som kan være tidkrevende og dyrt. Vi har utviklet en protokoll som gir mulighet for bestemmelse av bindingsaffiniteten av mikroskala Thermophoresis (MST) uten rensning av det aktuelle protein fra cellelysater. Fremgangsmåten omfatter overekspresjon av GFP-sammensmeltet protein og cellelyse i ikke-denaturerende betingelser. Anvendelse av metoden til STAT3-GFP forbigående uttrykt i HEK293-celler tillatt å fastslå for første gang affiniteten til godt studert transkripsjonsfaktor til oligonukleotider med forskjellige sekvenser. Protokollen er enkel og kan ha en rekke program for å studere interaksjoner av proteiner med små molekyler, peptider, DNA, RNA, og proteins.

Måling av affinitet av ikke-fosforylert STAT3 proteinbinding til oligonukleotider. HEK293 celler uttrykker STAT3-GFP ble brukt som en kilde til fluorescensmerkede STAT3 for DNA bindende analysen. Cellelysater ble fremstilt ved hjelp av RIPA-buffer (20x10 6 celler / ml). For binding undersøkelsene ble lysater fortynnet 150x med MST DNA-bindingsbuffer for å gi det optimale nivået av det fluorescerende protein i bindingsreaksjon (ca. 20 nM). Ikke-transfekterte HEK29...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikroskala Thermophoresis (MST) kan bli mye brukt til fastsettelse av bindende affinitet uten rensing av målet protein fra cellelysater. Protokollen omfatter overekspresjon av GFP-sammensmeltet protein, cellelyse i ikke-denaturerende betingelser, og påvisning av MST-signal i nærvær av varierende konsentrasjoner av ligand.

Protein Rensing-fri metode for Binding Affinity Fastsettelse av mikroskala Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonale Protein Purification Tilrettelagt av en Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifisering av Protein Samspill Partners Bruke Tandem Affinity Rensing

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Real-time analyser av Retinol Transport av membranen Receptor av Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

En protokoll for Fag Display og Affinitetsutvelgelse Bruke rekombinante protein agn

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...