Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Programa de Investigação intramuros do NIH, Instituto Nacional do Câncer, o Centro para Pesquisa do Câncer; Acordo Collaborative Research entre NCI e Calidris Therapeutics; American Cancer Society concessão IRG 97-152-17 de OT, e verbas federais a partir do National Cancer Institute, NIH, sob contrato HHSN26120080001E.

1. Preparação de lisado celular Este protocolo destina-se a células aderentes que expressam qualquer proteína GFP fundida. O número de células necessário pode variar de tão baixo quanto 6 a 10 até 20 x 10 6 células, dependendo do nível de expressão da proteína. Por exemplo, lisado de células HEK-sobre-expressam GFP STAT3 foi preparado por tratamento de células crescidas em frascos T75 10 a cerca de 70% de confluência com 1 ml de tampão de lise. No entanto...

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

A expressão de proteínas e de purificação é um passo trabalhoso e caro, o que é, no entanto, necessárias para a determinação do K D &#39;interacções pelo método mais usado actualmente. Aplicação de MST permite evitar a purificação de proteínas, assim, simplificar e acelerar significativamente caracterização quantitativa de interacções. Ele apresenta vantagens particularmente importantes no caso de-a-expressam difíceis e purificar proteínas, tais como proteínas de membrana e os factores...

Caracterização quantitativa da afinidade de interacções intermoleculares é importante em muitas áreas da investigação biomédica. Binding constante de dissociação (K D) é essencial não só na descoberta de drogas, mas também é um parâmetro importante na caracterização de qualquer interacção binário em qualquer sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para a detecção de interações proteína-proteína, tais como imunoprecipitação e fermento telas de dois híbridos, não nos informar sobre como apertada são essas interações, enquanto a afinidade define se este complexo particular, existe sob determinadas condições in vivo. No processo de descoberta de drogas, o desenvolvimento de ensaio de ligação é uma das mais necessárias e frequentes das etapas mais demoradas. Métodos mais comumente usados ​​de determinação K D incluem polarização de fluorescência, uma ressonância plasmon de superfície tecnologia (SPR), 2 ligação radioligante, 3 de calorimetria de titulação isotérmica, 4 equilibrihum diálise (ED), 5 de ultrafiltração (UF), 5 e ultracentrifugação (UC). 6 Todos eles requerem quantidades significativas de proteína alvo purificada. Termoforese microescala (MST) é um método rápido desenvolvimento que detecta o movimento dirigido de moléculas com um gradiente de temperatura microscópica. Quaisquer alterações da concha de hidratação de biomoléculas em resultado de uma mudança relativa do movimento ao longo do gradiente de temperatura. MST 7 é utilizado para determinar as afinidades de ligação e tem sido aplicado para estudar a ligação de proteínas marcadas com fluorescência ou ligandos fluorescentes ligando a uma proteína-alvo, 8. 9 MST permite a medição de interacções directamente em solução, sem a necessidade de imobilização de uma superfície (imobilização de tecnologia livre). Praticamente, qualquer ligação é acompanhada por uma mudança no sinal de MST, embora a dimensão da alteração varia de sistema para sistema significativamente. Para a detecção da molécula de movimento pelo MST, eles têm que ser fluorescênciant. Esta importante limitação do método pode ser transformado em uma vantagem. Se a proteína é expressa como uma fusão de GFP em qualquer sistema, que será a única molécula fluorescente e, assim, pode ser estudada, sem isolamento a partir do ligado de células ou sistema de expressão isento de células. Geração de lisados ​​de células que permitem a ligação com artefactos condições mínimas é o principal desafio. Aqui, nós descrevemos um protocolo de preparação da célula e ligado de experiência MST que pode ser usado para muitas proteínas solúveis e de membrana. Proteínas STAT são latentes factores de transcrição activados por citoplasmáticos fosforilação da tirosina em resposta a sinais extracelulares e estão envolvidos em muitos processos biológicos, incluindo imunidade, hematopoiese, inflamação e desenvolvimento. 10 Nos mamíferos, a família STAT STAT consiste de 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B e 6. Todas as estatísticas são activados sabe ligar-se a mesma sequência de DNA, assim chamado padrão GÁS, IFN-gama ativada sequência. No entanto, a transcriptional efeitos de diferentes estatísticas são muito diferentes. 11 Apesar de envolvimento em muitos processos patológicos e estudos extensivos rendendo mais de 17.000 publicações, a K D de STAT interacções com diferentes sequências de ADN que não foram determinadas. Apenas a afinidade relativa dos diferentes estatísticas às variantes do motivo de gás foi caracterizada. 11 Dificuldades na expressão e purificação de proteínas são os principais impedimentos para a caracterização da selectividade de ligação do ADN estatísticas. Embora a maioria dos estudos têm-se centrado sobre o papel dos Stats &quot;ativados&quot;, que se tornou sinônimo de fator de transcrição Tyr-fosforilada, o papel da não-fosforilada STATs (U-Stats) na regulação da transcrição está emergindo rapidamente. 12 No entanto, estes mecanismos são mal compreendidos, e não ficou claro se U-STATs realmente se ligar ao DNA ou agir através de interações com outros fatores de transcrição. Demonstrámos recentemente que a L-STAT3 pode ligar ao DNA sequencialmenteces diferentes motivos de gás com ainda maior afinidade 13. A descoberta tem implicações significativas para a nossa compreensão das funções biológicas desta importante proteína. Temos aplicado termoforese microescala para determinar as afinidades relativas de STAT3 ao gás e oligonucleótido rica em AT S 100 (Figura 4). Quase protocolo idêntico foi usado para a determinação de K D para a ligação de um ligando a STAT3 diferente, um inibidor de lipopéptido. 14 N a ligação de um factor de transcrição relacionadas, GFP-STAT1, que foi utilizado como um controlo negativo pode ser detectada confirmando assim a selectividade da interacção. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caracterização quantitativa das interações proteína é essencial em praticamente qualquer campo das ciências da vida, particularmente a descoberta da droga. A maioria dos métodos actualmente disponíveis de determinação de K D requerem acesso a proteína de interesse, a geração do qual pode ser demorado e caro purificada. Nós desenvolvemos um protocolo que permite a determinação da afinidade de ligação por termoforese microescala (MST) sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O método envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida e a lise das células em condições não desnaturantes. Aplicação do método para a STAT3-GFP expresso transitoriamente em células HEK293 permitem determinar, pela primeira vez que a afinidade do factor de transcrição bem estudado para oligonucleótidos com sequências diferentes. O protocolo é simples e pode ter uma variedade de aplicações para o estudo das interacções de proteínas com moléculas pequenas, péptidos, ADN, ARN, e proteins.

Medição da afinidade de ligação a oligonucleótidos STAT3 não fosforilada da proteína. As células HEK293 que expressam STAT3-GFP foram usados ​​como uma fonte de STAT3 marcado por fluorescência para ensaio de ligação de DNA. Os lisados ​​celulares foram preparados utilizando tampão RIPA (20x10 6 células / ml). Para estudos de ligação, os lisados ​​foram diluídos 150 vezes com MST tampão de ligação de ADN para fornecer o nível óptimo da...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

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