Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
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Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer; acuerdo de investigación colaborativa entre el NCI y Calidris Terapéutica, Sociedad Americana del Cáncer de subvención IRG 97-152-17 a OT, y fondos federales del Instituto Nacional del Cáncer, NIH, bajo HHSN26120080001E contrato.

1. Preparación de lisado celular Este protocolo está diseñado para las células adherentes que expresan cualquier proteína GFP-fundido. Se necesita el número de células puede variar desde tan bajo como 10 6 a un máximo de 20 x 10 6 células, dependiendo del nivel de expresión de la proteína. Por ejemplo, lisado de células HEK que sobreexpresan GFP-STAT3 se preparó mediante el tratamiento de las células cultivadas en matraces T75 10 a cerca de 70% de confluenci...

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	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Expresión y purificación de proteínas es un paso laborioso y costoso, que es, sin embargo, necesario para la determinación de las interacciones de los K D por el método más utilizado actualmente. Aplicación del MST permite evitar la purificación de proteínas simplificando y acelerando significativamente caracterización cuantitativa de las interacciones. Presenta ventajas particularmente importantes en el caso de difíciles de expresar y purificar proteínas, como las proteínas de membrana y factore...

Caracterización cuantitativa de la afinidad de las interacciones intermoleculares es importante en muchas áreas de la investigación biomédica. Encuadernación constante de disociación (KD) es esencial no sólo en el descubrimiento de fármacos, pero también es un parámetro importante en la caracterización de cualquier interacción binaria en cualquier sistema biológico. Métodos bioquímicos utilizados para la detección de interacciones proteína-proteína, como la inmunoprecipitación y la levadura híbrido de dos pantallas, no nos informan sobre el grado de tensión son las interacciones, mientras que la afinidad define si existe este complejo particular, en determinadas condiciones in vivo. En el proceso de descubrimiento de fármacos, desarrollo de ensayos de unión es uno de los más necesarios y con frecuencia los pasos que más tiempo consume. Los métodos más utilizados de determinación K D incluyen la polarización de fluorescencia, tecnología 1 resonancia de plasmones superficiales (SPR), 2 radioligand vinculante, 3 calorimetría de titulación isotérmica, 4 equilibrium diálisis (ED), 5 de ultrafiltración (UF), 5 y ultracentrifugación (UC). 6 Todos ellos requieren cantidades importantes de proteína diana purificada. Termoforesis microescala (MST) es un método rápido desarrollo que detecta el movimiento dirigido de las moléculas en un gradiente de temperatura microscópica. Cualquier cambio de la capa de hidratación de biomoléculas resultado en un cambio relativo de movimiento a lo largo del gradiente de temperatura. 7 MST se utiliza para determinar las afinidades de unión y se ha aplicado para el estudio de unión a las proteínas marcadas con fluorescencia o ligandos fluorescentes ligando a una proteína diana. 8, 9 MST permite la medición de las interacciones directamente en solución sin la necesidad de inmovilización a una superficie (inmovilización libre de la tecnología). Prácticamente, cualquier unión es acompañado por un cambio en la señal de MST, aunque el tamaño del cambio difiere de sistema a sistema de manera significativa. Para la detección de movimiento molécula por MST, que tienen que ser fluorescenciant. Esta limitación importante del método se puede convertir en una ventaja. Si una proteína se expresa como una fusión GFP en cualquier sistema, que será la única molécula fluorescente y por lo tanto puede ser estudiado sin aislamiento a partir del lisado celular o sistema de expresión libre de células. Generación de lisados ​​celulares que permiten las condiciones de unión con artefactos mínimos es el principal desafío. Aquí se describe un protocolo de preparación de lisado celular y experimentar MST que se puede utilizar para muchas proteínas solubles y de membrana. Proteínas STAT están latentes factores de transcripción citoplasmáticos activados por la fosforilación de tirosina en respuesta a señales extracelulares y están implicadas en muchos procesos biológicos, incluyendo la inmunidad, la hematopoyesis, inflamación, y el desarrollo. 10 En los mamíferos, la familia STAT consta de STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B, y 6. Todas las estadísticas activadas se sabe que se unen a la misma secuencia de ADN, por lo que llama motivo GAS, IFN-gamma activado secuencia. Sin embargo, la transcriPCIONAL efectos de diferentes STAT son muy diferentes. 11 A pesar de la participación en muchos procesos patológicos y extensos estudios que producen más de 17.000 publicaciones, la K D de las interacciones STAT con diferentes secuencias de ADN no se han determinado. Sólo afinidad relativa de las diferentes estadísticas con las variantes del motivo GAS se ha caracterizado. 11 Las dificultades en la expresión y purificación de proteínas son los principales obstáculos en la caracterización de la selectividad de unión a ADN estadísticas de la &#39;. Aunque la mayoría de los estudios se han centrado en el papel de la Stats &quot;activados&quot;, que se convirtió en sinónimo de factor de transcripción Tyr-fosforilada, el papel de STAT no fosforilada (U-STAT) en la regulación de la transcripción está emergiendo rápidamente. 12 Sin embargo, estos mecanismos no se entienden bien, y no estaba claro si U-STAT en realidad se unen a ADN o actuar a través de interacciones con otros factores de transcripción. Recientemente hemos demostrado que U-STAT3 puede unirse al ADN secuencialces diferente de motivos de gas con aún mayor afinidad. 13 El hallazgo tiene implicaciones importantes para nuestra comprensión de las funciones biológicas de esta importante proteína. Hemos aplicado termoforesis microescala para determinar las afinidades relativas de STAT3 a GAS y oligonucleótido rico en AT de S 100 (Figura 4). Casi idéntico protocolo se ha usado para la determinación de K D para la unión de un ligando de STAT3 diferente, un inhibidor de lipopéptido. 14 No se unión a un factor de transcripción relacionado, GFP-STAT1 que se utilizó como control negativo podría ser detectado confirmando de este modo la selectividad de interacción. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Caracterización cuantitativa de las interacciones proteína es esencial en prácticamente cualquier campo de las ciencias de la vida, en particular el descubrimiento de fármacos. La mayoría de los métodos actualmente disponibles de determinación de K D requieren acceso a la proteína de interés, la generación de los cuales puede ser mucho tiempo y es caro purificada. Hemos desarrollado un protocolo que permite la determinación de la afinidad de unión por termoforesis microescala (MST) sin purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El método implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido y lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes. Aplicación del método de STAT3-GFP expresa transitoriamente en células HEK293 permitieron determinar por primera vez la afinidad del factor de transcripción bien estudiado a oligonucleótidos con diferentes secuencias. El protocolo es sencillo y puede tener una variedad de aplicaciones para el estudio de interacciones de proteínas con moléculas pequeñas, péptidos, ADN, ARN, y proteins.

La medición de la afinidad de los no fosforilados STAT3 proteína de unión a oligonucleótidos. Células HEK293 que expresan STAT3-GFP se utilizaron como una fuente de la etiqueta fluorescente STAT3 para el ensayo de unión al ADN. Los lisados ​​celulares se prepararon utilizando tampón RIPA (20x10 6 células / ml). Para los estudios de unión, los lisados ​​se diluyeron 150 veces con tampón de unión a ADN MST para proporcionar el nivel óptimo de la pro...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Termoforesis microescala (MST) puede ser ampliamente utilizado para la determinación de la afinidad de unión sin la purificación de la proteína diana a partir de lisados ​​celulares. El protocolo implica la sobreexpresión de la proteína GFP-fundido, lisis de las células en condiciones no desnaturalizantes, y la detección de la señal de MST en presencia de concentraciones variables del ligando.

Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

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