Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Detta arbete har delvis stöd av Interna forskningsprogram av NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, Collaborative Research Avtal mellan NCI och Calidris Therapeutics, American Cancer Society bidrag IRG 97-152-17 till OT, och federala medel från National Cancer Institute, NIH, enligt avtal HHSN26120080001E.

Ett. Framställning av Cell Lysate Detta protokoll är avsedd för vidhäftande celler som uttrycker en GFP-fusionsprotein. Behövs cellantalet kan variera från så lite som 10 6 till så många som 20 x 10 6 celler, beroende på nivån av proteinuttryck. Till exempel var lysat av HEK-celler som överuttrycker GFP-STAT3 framställas genom behandling av celler odlade i 10 T75-kolvar till nära 70% konfluens med 1 ml lysbuffert. Detta hade dock lysat att spädas 150 gånge...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Proteinexpression och rening är ett mödosamt och dyrt steg, vilket är dock nödvändigt för fastställande av interaktioner &quot;K D av mest använda metoden. Tillämpning av MST tillåter undvika proteinupprening därmed väsentligt förenkla och påskynda kvantitativ karaktärisering av interaktioner. Den presenterar särskilt betydande fördelar när det gäller svåra att uttrycka och rena proteiner såsom membranproteiner och transkriptionsfaktorer. Den största begräns...

Kvantitativ bedömning av affinitet av intermolekylära interaktioner är viktigt inom många områden av biomedicinsk forskning. Bindande dissociationskonstant (Kd) är viktigt inte bara för läkemedelsutveckling, men är också en viktig parameter i karakterisering av alla binära interaktion i någon biologiskt system. Biokemiska metoder som används för detektion av protein-protein-interaktioner, såsom immunprecipitation och jäst två-hybrid skärmar, inte informerar oss om hur hårt är dessa interaktioner, medan samhörighet definierar om detta komplex existerar under givna betingelser in vivo. I forskningsprocessen är bindande analys utveckling en av de nödvändiga och ofta de mest tidskrävande steg. Vanligaste metoderna för Kd bestämning inkluderar fluorescenspolarisering, 1 ytplasmonresonans (SPR), 2 radioligandbindning, 3 isotermiska titrering kalorimetri, 4 jämviktsarbetslösheum dialys (ED), 5 ultrafiltrering (UF), 5 och ultracentrifiigering (UC). 6 Alla av dem kräver stora mängder renat målprotein. Mikroskala thermophoresis (MST) är en snabbt växande metod som detekterar riktad rörelse av molekyler i en mikroskopisk temperaturgradient. Eventuella förändringar av hydratiseringen skal av biomolekyler resulterar i en relativ förändring av rörelse längs temperaturgradienten. 7 MST används för att bestämma bindningsaffiniteter och har tillämpats för att studera ligandbindning till fluorescensmärkta proteiner eller fluorescerande ligander till ett målprotein. Åtta, 9 MST medger mätning av interaktioner direkt i lösning utan behov av immobilisering till en yta (immobilisering-fri teknik). Praktiskt, är någon bindande åtföljs av en förändring i MST-signal, även om storleken på förändringen skiljer sig från system till system betydligt. För detektering av molekylen rörelse av MST, måste de fluorescerarnt. Denna betydande begränsning av metoden kan vändas till en fördel. Om ett protein uttrycks som en GFP fusion i alla system, kommer det att vara den enda fluorescerande molekyl och sålunda kan studeras utan isolering från cellysatet eller cellfria expressionssystem. Generering av cellysater som möjliggör bindande villkor med minimala artefakter är den stora utmaningen. Här beskriver vi ett protokoll för cellysat förberedelse och MST experiment som kan användas för många lösliga proteiner och membranproteiner. STAT-proteiner är latenta cytoplasmatiska transkriptionsfaktorer aktiveras av tyrosinfosforylering som svar på extracellulära signaler och är inblandade i många biologiska processer inklusive immunitet, blodbildningen, inflammation, och utveckling. 10 Hos däggdjur består STAT familjen STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B och 6. Alla aktiverade statistik är kända för att binda till samma DNA-sekvens, så kallade GAS motiv, IFN-gamma aktiverad sekvens. Men den transcririvilligt effekter av olika statistik är mycket olika. 11 Trots medverkan i många patologiska processer och omfattande undersökningar som ger över 17.000 publikationer, har K D i STAT interaktioner med olika DNA-sekvenser inte fastställts. Endast relativ affinitet för olika statistik på varianter av gas motiv har karakteriserats. 11 Svårigheter i protein expression och rening är de största hindren för karakterisering av statistik &#39;DNA-bindande selektivitet. Även om majoriteten av studier har fokuserat på rollen som &quot;aktiverade&quot; statistik, som blev synonymt med Tyr-fosforylerad transkriptionsfaktor, den roll som icke-fosforylerade Stats (U-statistik) i regleringen av transkription växer fram snabbt. 12 dock dessa mekanismer är dåligt kända, och det var oklart om U-Stats faktiskt binda till DNA eller agera genom interaktioner med andra transkriptionsfaktorer. Vi har nyligen visat att U-STAT3 kan binda till DNA SekvensenCES annorlunda GAS motiv med ännu högre affinitet. 13 Konstaterandet har viktiga implikationer för vår förståelse av de biologiska funktionerna hos denna viktiga protein. Vi har tillämpat mikroskala thermophoresis för att bestämma relativa affiniteterna hos STAT3 till GAS och AT-rik oligonukleotid S 100 (figur 4). Nästan identiska protokoll har använts för Kd bestämning för bindning av en annan STAT3 ligand, en lipopeptid inhibitor. 14 Ingen bindning till en närstående transkriptionsfaktor, GFP-STAT1 som användes som en negativ kontroll kunde detekteras vilket bekräftar selektivitet interaktion. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Kvantitativ karakterisering av protein interaktioner är viktigt i nästan alla områden för biovetenskap, särskilt läkemedelsutveckling. De flesta närvarande tillgängliga metoder för Kd beslutsamhet kräver tillgång till renat protein av intresse, generation som kan vara tidskrävande och dyrt. Vi har utvecklat ett protokoll som möjliggör bestämning av bindningsaffinitet genom mikroskala thermophoresis (MST) utan rening av målproteinet från cellysat. Metoden involverar överuttryck av GFP-fusionsproteinet och cellys i icke-denaturerande betingelser. Tillämpning av metoden för att STAT3-GFP uttryckt transient i HEK293-celler tillåts att bestämma för första gången affiniteten för väl studerade transkriptionsfaktor till oligonukleotider med olika sekvenser. Protokollet är enkelt och kan ha en mängd av ansökan för att studera interaktioner mellan proteiner med små molekyler, peptider, DNA, RNA, och proteins.

Mätning av affiniteten av icke-fosforylerat STAT3 protein bindning till oligonukleotider. HEK293-celler som uttrycker STAT3-GFP användes som en källa för fluorescensmärkt STAT3 för DNA-bindningsanalysen. Cellysat framställdes med användning av RIPA-buffert (20x10 6 celler / ml). För bindningsstudier, lysaten späddes 150x med MST DNA-bindningsbuffert för att ge den optimala nivån för det fluorescerande proteinet i bindningsreaktionen (ca 20 nM). Icke-tran...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Microscale thermophoresis (MST) kan ofta används för bestämning av bindningsaffinitet utan rening av målproteinet från cellysat. Protokollet involverar överuttryck av GFP-fuserade proteinet, cellys i icke-denaturerande betingelser, och detektion av MST-signal i närvaro av varierande koncentrationer av liganden.

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume proteinkoncentration Fastställande med NanoDrop 2000C Spektrofotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Clip - En metod för att identifiera transkriptom hela bindningar på RNA-proteiner

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Blås-medierad affinitetskromatografi med magnetkamera Aktivt cellsortering (LIMACS): en ny metod för att analysera protein-lipid Interaktion

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biokemiska Ombildning av steroidreceptoreffekten • Hsp90 proteinkomplex och Reaktivering av ligandbindande

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonal proteinrening underlättas av en liten Bispecific Affinity Tagg

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Realtid Analyser av Retinol Transport från membranreceptor av plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Ett protokoll för Fag Display och Affinity val med rekombinanta protein Beten

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...