Name: protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis
Uploaded: 2013-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Gelen ve federal fonların, NCI ve Calidris Tedavi arasındaki işbirliği araştırma Anlaşma,, OT için Amerikan Kanser Derneği hibe IRG 97-152-17 Bu çalışma kısmen NIH, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir sözleşme HHSN26120080001E altında Ulusal Kanser Enstitüsü, NIH,.

1. Hücre lizatının hazırlanması Bu protokol, bir GFP kaynaşık proteini ifade yapışık hücreler için tasarlanmıştır. Gerekli hücre sayısı protein ifade seviyesine bağlı olarak, gibi düşük bir çok 20 x 10 6 hücre 6 10 olarak değişebilir. Örneğin, HEK hücreleri eksprese GFP-STAT3 lizat 1 mL lizis tamponu ile% 70 yakın konfluent 10 T75 şişeleri içinde yetiştirilen hücreler muamele etmek suretiyle hazırlandı. Bununla birlikte, bu lizat MST ...

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+analytical+ultracentrifugation+in+protein+science:+a+tutorial+review.">Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review.</a> Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).</li><li>Duhr, S., Braun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+molecules+move+along+a+temperature+gradient.">Why molecules move along a temperature gradient.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).</li><li>Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+thermophoresis+as+a+sensitive+method+to+quantify+protein:+nucleic+acid+interactions+in+solution.">Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution.</a> Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).</li><li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis.">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nat. Commun. 1, 100 (2010).</li><li>Stark, G. R., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK-STAT+pathway+at+twenty.">The JAK-STAT pathway at twenty.</a> Immunity. 36, 503-514 (2012).</li><li>Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+binding+specificity+of+different+STAT+proteins.+Comparison+of+in+vitro+specificity+with+natural+target+sites.">DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites.</a> J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).</li><li>Yang, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, ancak, en güncel olarak kullanılan yöntem ile etkileşimleri &quot;Kd belirlenmesi için gerekli olan bir zahmetli ve pahalı bir adımdır. MST uygulanması önemli ölçüde etkileşimlerinin kantitatif karakterizasyonu basitleştirilmesi ve hızlandırılması böylece protein saflaştırma kaçınarak sağlar. Bu tür bir zar proteinleri ve transkripsiyon faktörleri olarak zor olan açıklama ve saflaştırmak proteinler durumunda, özellikle önemli bir ava...

Moleküller arası etkileşim yakınlık nicel karakterizasyonu biyomedikal araştırma birçok alanda önemlidir. Bağlama sabiti (Kd) ayrılma sadece ilaç keşfi değil, aynı zamanda gerekli olan herhangi bir biyolojik sistem herhangi bir ikili etkileşim karakterizasyonu önemli bir parametredir. Bu immunoprecipitation ve maya iki hibrit ekran gibi protein-protein etkileşimleri tespiti için kullanılan biyokimyasal yöntemler, yakınlık bu özel kompleks in vivo olarak verilen koşullar altında olup olmadığını tanımlar iken nasıl sıkı bu etkileşimler vardır bize haber yok. Ilaç keşfi işlemde, bağlanma tahlili geliştirilmesi gerekli ve sıklıkla en çok zaman tüketen aşamalar biridir. K D belirlenmesi En sık kullanılan yöntemler floresan polarizasyon, 1 yüzey plazmon rezonans (SPR) teknolojisi, 2 radyo-bağlama, 3 izotermal titrasyon kalorimetre, 4 equilibri dahilum diyaliz (ED), 5 ultrafiltrasyon (UF), 5 ve ultra-santrifüj (UC). 6 bunların tüm hedef saflaştırılmış proteinin önemli miktarlarda gerektirir. Mikro Termoforosis (MST) bir mikroskobik sıcaklık degrade moleküllerin yönelik hareketi algılayan hızla gelişen bir yöntemdir. Sıcaklık eğimi boyunca hareket göreli bir değişiklik biyomoleküllerin sonucu hidrasyon kabuk herhangi bir değişiklik. 7 MST bağlanma afiniteleri belirlemek için kullanılan ve bir hedef proteine ​​floresan ile etiketlenmiş proteinleri, ya da floresan ligandlarına ligand incelemek için uygulanmıştır. 8, 9 MST bir yüzeye immobilizasyon ihtiyacı (immobilizasyon-ücretsiz teknolojisi) doğrudan çözüm etkileşimleri ölçümü sağlar. Değişikliğin boyutunu önemli ölçüde sistemden sisteme farklı olmasına rağmen, pratik olarak herhangi bir bağlayıcı, MST sinyali bir değişiklik eşlik eder. MST tarafından molekülün hareket tespiti için, floresan gerekirnt. Yöntemin bu büyük sınırlama bir avantaj dönüştürülebilir. Bir protein herhangi bir sistem, bir GFP füzyon olarak ifade edilirse, bu tek flüoresan molekül olacak ve böylece hücre lizatı veya hücre içermeyen ekspresyon sisteminden izole edilmeden incelenebilir. Az eserler ile bağlama koşulları için izin hücre lizatları üretimi önemli bir sorundur. Burada birçok Çözünür ve zar proteinleri için kullanılabilir hücre lizatı hazırlanması ve MST deney bir protokol açıklamaktadır. STAT proteinleri hücre dışı sinyallere yanıt olarak tirosin fosforilasyon ile aktif hale sitoplazmik transkripsiyon faktörleri gizli olan ve bağışıklık, hematopoiez, iltihaplanma, ve gelişme. Memelilerde 10 de dahil olmak üzere birçok biyolojik proseslerde yer alan, STAT etti STAT 1, 2, 3, 4 oluşmaktadır , 5A, 5B ve 6. Bütün aktif STAT aynı DNA sekansına bağlamak için bilinen, bu nedenle GAZ motifi olarak adlandırılan, IFN-gama sekansı aktifleştirildi. Bununla birlikte, transcriFarklı STAT bir ptional etkileri çok farklıdır. 11. birçok patolojik süreçler ve 17.000 yayınlar üzerinde verimli yoğun çalışmalar karışmakla rağmen, farklı DNA dizileri ile STAT etkileşimleri K D belirlenmemiştir. GAZ motifinin varyantlarına farklı durum arasında sadece göreli afinite karakterize edilmiştir. Protein ekspresyonu ve saflaştırılması, 11 güçlükler istatistik &#39;DNA bağlama seçicilik karakterizasyonu en önemli engeller vardır. Çalışmaların çoğunluğu Tyr-fosforile transkripsiyon faktörü için eş anlamlı hale geldi &quot;aktif&quot; STAT, transkripsiyon düzenlenmesi olmayan fosforile STAT (U-STAT) rolü rolü odaklanmış olmasına rağmen hızla ortaya çıkmaktadır. 12. Ancak, bu mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır, ve U-STAT aslında DNA bağlamak ya da diğer transkripsiyon faktörleri ile etkileşim yoluyla hareket kesin değildi vardır. Yakın zamanda U-STAT3 DNA istif bağlamak göstermiştirdaha yüksek afinite ile GAZ motifleri farklı ces. 13 bulgu bu önemli proteinin biyolojik fonksiyonları anlayışımızı için önemli etkileri vardır. Biz GAZ için STAT3 göreceli yakınlık belirlemek için mikro Termoforosis uygulanan ve AT-zengin oligonükleotid S +100 (Şekil 4) var. Hemen hemen aynı protokol farklı bir STAT3 ligandı bir lipopeptid inhibitör bağlanma için Kd tayini için kullanılmıştır. 14, negatif bir kontrol olarak kullanılmıştır ilgili bir transkripsiyon faktörü, GFP STAT1 bağlanma Resim böylece etkileşim seçiciliği teyit saptanabilir. 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

Protein etkileşimleri kantitatif karakterizasyonu özellikle yaşam bilimleri, ilaç keşfi hemen her alanında gereklidir. K D tayin mevcut yöntemlerin çoğu zaman alıcı ve pahalı olabilir nesil olan ilgi protein, saflaştırılmış erişim gerektirir. Bu hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan mikro Termoforosis (MST) ile bağlanma afinitesinin belirlenmesine olanak sağlayan bir protokol geliştirmiştir. Yöntem, denatüre edici olmayan koşullar altında GFP kaynaşık protein ve hücre lisisinin aşırı içerir. STAT3-GFP yönteminin uygulanması geçici olarak ilk kez farklı dizileri ile oligonükleotidler için en iyi incelenmiş olan transkripsiyon faktörünün afinitesini belirlemek için izin HEK293 hücrelerinde ifade edilmiştir. Protokol basittir ve küçük moleküller, peptidler, DNA, RNA ile protein etkileşimleri çalışmak için uygulama çeşitli olabilir, ve proteins.

Oligonükleotidler için bağlayıcı olmayan fosforile STAT3 protein afinitesi ölçülmesi. STAT3-GFP eksprese eden HEK293 hücreleri DNA bağlama deneyi için floresan etiketli STAT3 kaynağı olarak kullanılmıştır. Hücre lizatları RIPA tamponu (20x10 6 hücre / ml) kullanılarak hazırlandı. Bağlama çalışmaları için, lizatları bağlanma reaksiyonu (20 nM) &#39;de floresan protein en uygun düzeyde sağlamak için MST DNA bağlayıcı tampon maddesi ...

Watch this Scientific Journal Video about Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis at JoVE.com

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Mikro Termoforosis (MST) yaygın olarak hücre lizatlarından hedef proteinin arıtılmadan bağlanma afinitesinin belirlenmesinde kullanılabilir. Protokol, GFP-kaynaşık proteini, denatüre edici olmayan koşullar hücre parçalama ve ligand arasında değişen konsantrasyonlarda varlığında MST sinyalinin tespiti arasında aşırı içerir.

Mikro Termoforosis tarafından Bağlama Affinity belirlenmesi Protein Saflaştırma-ücretsiz Yöntemi

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

PAR-Klip - RNA Cilt Proteinler Transcriptome geniş Cilt Siteleri Belirlemek Amacıyla Bir Yöntem

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Biochemical Reconstitution of Steroid ReceptorÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â¢Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Steroid Reseptör Biyokimyasal Sulandırma Ligand • Protein Hsp90 Kompleksleri ve Yeniden bağlayıcı

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Küçük Bispecific Affinity Tag Kolaylaştırılmış Ortogonal Protein Saflaştırma

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Tandem Affinity Arıtma kullanarak Protein etkileşim Ortaklar belirlenmesi

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Plazma Retinol Bağlayıcı Protein Membran Reseptör tarafından Retinol Ulaştırma Gerçek zamanlı Analizleri

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...