Name: synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors
Uploaded: 2013-09-10T10:00:00
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Discussions utiles avec Isja de Feijter et Matt Baker grandement appréciée.

Une. Synthèse des capteurs <ol><li> Dans la section suivante, nous proposons une procédure pour la conjugaison d&#39;indicateurs de pH de dendrimères PAMAM. Le même protocole peut être appliqué avec une modification minimale de substitution amine dendrimères porteurs. 5,17,13,14 dendrimères et les colorants disponibles dans le commerce peuvent être utilisés sans autres purifications. </li><li> Dissoudre le dendrimère dans du DMSO anhydre (50 uM de concentration finale). Préparer des solutions de...

<ol>
	<li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fluorescent+Toolbox+for+Assessing+Protein+Location+and+Function.">The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li><li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+intracellular+pH.">Fluorescent indicators for intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li><li>Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+ion+imaging+using+fluorescent+dyes:+artefacts+and+limits+to+resolution.">Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution.</a> Pfl&#252;gers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).</li><li>Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+and+Subcellular+Targeting+of+Dendrimer-Based+Fluorescent+pH+Sensors+in+Living+Cells.">Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).</li><li>Lee, C. C., MacKay, J. A., Fr&#233;chet, J. M. J., Szoka, F. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+bioactivity+of+internally+functionalized+cationic+dendrimers+with+PEG+cores.">Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores.</a> Biomacromolecules. , (2012).</li><li>Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+Functionalization+of+Dendrimers+Regulates+Internalization+and+Intracellular+Trafficking+in+Living+Cells.">Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells.</a> Bioconjugate chemistry. , (2012).</li><li>Sakadzi&#263;, S., Roussakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nature. 7 (9), 755-759 (2010).</li><li>Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+GFP-based+ratiometric+excitation+and+emission+pH+indicator+for+intracellular+studies.">Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies.</a> Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).</li><li>Albertazzi, L., Brondi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendrimer-based+fluorescent+indicators:+in+vitro+and+in+vivo+applications.">Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications.</a> PloS one. 6 (12), e28450 (2011).</li><li>Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+Trackable+Dendritic+Scaffolds+and+Delivery+Agents.">Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).</li><li>Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+intracellular+chloride+and+pH+measurements+using+a+GFP-based+sensor.">Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor.</a> Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).</li><li>Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+Needle+in+a+Haystack:+Identification+of+EGFP+Tagged+Neurons+during+Calcium+Imaging+by+Means+of+Two-Photon+Spectral+Separation.">Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation.</a> Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).</li><li>Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seizure+termination+by+acidosis+depends+on+ASIC1a.">Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a.</a> Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li></ol>

Les étapes essentielles pour l&#39;imagerie de pH réussie avec des capteurs à base de dendrimères sont: i) la sélection de l&#39;échafaudage dendritique correct et le nombre d&#39;indicateurs conjugués à elle et ii) l&#39;optimisation du protocole de distribution de capteur dans des cellules ou in vivo. Le mode opératoire de synthèse est relativement simple et peut être appliquée à pratiquement tous polymère hyperbranché amine portant. Les capteurs peuvent être obten...

L&#39;utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd&#39;hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. 1 Une amélioration pertinente a été représentée par l&#39;élaboration d&#39;indicateurs de fluorescence , c&#39;est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentration d&#39;une entité moléculaire spécifique. pH et de calcium indicateurs en particulier ont eu un impact dramatique sur l&#39;étude de la physiologie de la cellule en raison de l&#39;énorme importance de H + et Ca 2 + dans la biologie. 2,3 Cependant, la plupart des colorants de détection présentent plusieurs limites intrinsèques liés à leur petite molécule comportements tels que: i) des difficultés à targeti subcellulaireng, ii) une faible solubilité dans l&#39;eau et par conséquent une mauvaise biocompatibilité,., et iii) des fuites de cellules et donc un manque de capacité à long imagerie time-lapse 4 En outre, le signal de plusieurs sondes ne peut pas être corrigée en fonction de la dépendance de la concentration de colorant (non Imagerie ratiométrique) et, par conséquent, une mesure absolue dans des cellules ou in vivo n&#39;est pas possible. Nous avons récemment décrit une méthode simple et efficace pour surmonter ces limitations, en fonction de la conjugaison de colorants de détection sur un échafaudage de dendrimère. 5 Les dendrimères sont des polymères hyper-ramifiés monodispersés avec des propriétés très attrayantes pour des applications biologiques. 6 en particulier plusieurs architectures dendritiques ont été mis au point et utilisé pour le médicament 7 et la livraison de gènes. 8 n&#39;est que très récemment plusieurs groupes ont commencé à explorer le potentiel de ces molécules comme échafaudage pour dispositifs de détection. 9,10,11 Nous avons déjàdécrit une voie de synthèse facile vers la fonctionnalisation différente de polyamidoamine (PAMAM) des échafaudages à base d&#39;esters de NHS-activées. conjugués peuvent 12 être obtenus en une seule étape au moyen d&#39;une dialyse en tant que purification. Fait intéressant, cette approche peut facilement être appliquée à une variété d&#39;échafaudages dendritiques ou polymères. 13,14 Pour atteindre les dendrimères d&#39;imagerie ratiométrique étaient doublement marquée avec deux ensembles de colorants: i) un indicateur de pH (par exemple la fluorescéine) et ii) un fragment fluorescent indépendante du pH (par exemple la rhodamine). Cela nous a permis d&#39;effectuer une imagerie précise du pH comme le rapport entre la fluorescéine et la rhodamine est seulement dépendante du pH et de pas plus de la concentration de la sonde. Une autre approche intéressante à ce sujet est représenté par l&#39;utilisation de sondes à base de vie. 15 Comme la durée de vie ne dépend pas de la concentration de la sonde ces mesures n&#39;ont pas besoin d&#39;une correction de quotient. Cependant, lifmesures de etime nécessitent une configuration instrumentale plus complexe et leur résolution temporelle est sous-optimale pour les processus physiologiques rapides, limitant ainsi leurs applications potentielles. Dans le but d&#39;effectuer une imagerie intracellulaire, la sonde doit être délivré à travers la membrane plasmique dans le cytosol. Comme les dendrimères sont pas perméable en raison de leur taille et leur caractère hydrophile, la délivrance intracellulaire pourrait être réalisé par électroporation. Au moyen de cette technique, largement utilisé en biologie pour la transfection, les macromolécules marquées peuvent être exécutés de manière efficace dans des cellules d&#39;effectuer une imagerie de haute qualité. En outre, l&#39;électroporation avec les complications liées à dendrimère endocytose peuvent être évités en tant que les macromolécules sont directement remis au cytoplasme. Intéressant après électroporation différents dendrimères montre localisations distinctes à l&#39;intérieur des cellules, même en l&#39;absence de toute séquence de ciblage spécifique. 5 Ce passife ciblage, seulement en raison des propriétés physico-chimiques du dendrimère, pourrait être exploitée pour obtenir un pH d&#39;imagerie spécifiques à des organites. Imagerie ratiométrique peut être effectuée en utilisant la microscopie confocale. La fluorescéine et la rhodamine, conjugué de manière covalente à l&#39;échafaud dendritique, ont été séparément imagées et un rapport carte pixel par pixel a été créé. Plusieurs procédures de contrôle le pH intracellulaire dans les cellules vivantes au moyen d&#39;ionophores ont été signalés. Ionophores sont de petites molécules hydrophobes capables de transporter des ions à travers la membrane plasmique; ionophores pour ion H +, comme nigéricine, sont disponibles et peuvent être utilisés pour étalonner les capteurs à base de dendrimères 16 Ces mesures ont révélé une réponse linéaire de pH similaire à ce qui est observé. in vitro. Sur la base de l&#39;étalonnage du pH intracellulaire peut être mesurée avec précision. Ces mesures ont démontré que le capteur à base de dendrimères peut être un outil précieux dans l&#39;étude H + homeostasis dans les cellules vivantes et les processus pathologiques qui impliquent pH dysfonctionnements de régulation. Nous avons récemment démontré que les capteurs de pH à base de dendrimères peuvent également être appliqués in vivo, effectuer une imagerie de pH dans le cerveau de souris anesthésiées. 17 En raison de l&#39;environnement complexe des tissus vivants de haute qualité dans la détection in vivo est techniquement difficile. Ici, nous montrons une description détaillée de la procédure expérimentale in vivo pour pH imagerie avec un accent des questions cruciales à traiter pour effectuer une imagerie précise du pH dans le cerveau. Microscopie à deux photons a été utilisé pour deux raisons principales: i) l&#39;utilisation de la lumière infrarouge permet de pallier le manque de pénétration tissulaire de la microscopie confocale norme; ii) la large absorption à deux photons de la fluorescéine et de la rhodamine permettre leur excitation simultanée d&#39;éviter la les complications liées à l&#39;utilisation de deux longueurs d&#39;onde pour l&#39;excitation. des mesures de pH dans le cerveau de la souris étaientmenées à bien; capteurs répondent que difficilement à l&#39;hypoxie induire des changements de pH dans l&#39;espace extracellulaire du cerveau. Ces mesures montrent que les indicateurs à base de dendrimères peuvent être utilisés avec succès pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques de pH in vivo dans un modèle animal.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
		 <td>Company</td>
		 <td>Catalogue number</td>
		 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
	 <tr>
	 <td>PAMAM G4</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>412449</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Carboxyfluorescein NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1311</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>TMR NHS ester</td>
		 <td>Life technologies</td>
		 <td>C-1171</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>DMSO</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>D8418</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Dyalsis bags</td>
		 <td>Spectrum Labs</td>
		 <td>132117</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>WillCo Dishes</td>
		 <td>WillCo Wells</td>
		 <td>GWSt-3512</td>
		 <td></td>
	 </tr>
	 <tr>
	 <td>Urethane</td>
		 <td>Sigma-Aldrich</td>
		 <td>U2500</td>
		 <td></td>
	 </tr>
 </tbody>
</table>

synthesis, cellular delivery and in vivo application of dendrimer-based ph sensors

Le développement d&#39;indicateurs fluorescents représenté une révolution pour les sciences de la vie. Codées génétiquement et fluorophores synthétiques avec des capacités de détection permis la visualisation d&#39;espèces biologiquement pertinentes avec une résolution spatiale et temporelle. Colorants synthétiques sont particulièrement intéressants grâce à leur grande accordabilité et la vaste gamme d&#39;analytes mesurables. Cependant, ces molécules souffrent de plusieurs limitations liées à petite molécule comportement (faible solubilité, les difficultés de ciblage, souvent sans imagerie quotientométrique autorisé). Dans ce travail, nous introduisons le développement des capteurs à base de dendrimères et de présenter un mode opératoire pour la mesure du pH in vitro, dans des cellules vivantes et in vivo. Nous choisissons dendrimères comme plate-forme idéale pour nos capteurs pour leurs nombreuses propriétés souhaitables (de monodispersité, propriétés accordables, polyvalence) qui en font un échafaudage largement utilisé pour plusieurs dispositifs biomédicaux faites. La conjugaison de pH fluorescentindicateurs à l&#39;échafaud des dendrimères ont conduit à une amélioration de leurs performances de détection. En particulier dendrimères exposition réduite fuite de cellule, un meilleur ciblage intracellulaire et permettre des mesures ratiométriques. Ces nouveaux capteurs ont été utilisés avec succès pour mesurer le pH dans la vie des cellules HeLa et in vivo dans le cerveau de la souris.

La figure 1 montre une représentation schématique de la détection de la conjugaison de colorants différents échafaudages dendritiques. Les indicateurs qui en résultent peuvent être obtenues dans une étape de synthèse simple à partir de produits disponibles dans le commerce. Dendrimères amine portant sont mis à réagir avec des colorants NHS activés dans le DMSO et purifiés par dialyse. Ce mode opératoire général a déjà été utilisé avec succès pour le marquage de plusieurs dendrim?...

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

capteurs de fluorescence sont des outils puissants en sciences de la vie. Nous décrivons ici une méthode pour synthétiser et utiliser des capteurs fluorescents à base de dendrimères pour mesurer le pH dans les cellules vivantes et in vivo. L&#39;échafaudage dendritique améliore les propriétés de colorants fluorescents conjugués conduisant à des propriétés de détection améliorées.

Synthèse, Livraison cellulaire et<em&gt; In vivo</em&gt; Utilisation de capteurs de pH à base de dendrimères

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

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