Name: whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo
Uploaded: 2013-07-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust e della British Heart Foundation.

Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente indicato. 1. Enucleazione e la fissazione di postnatali Occhi <ol><li> Posizionare il mouse eutanasia cucciolo su un lato, togliere la pelle che copre gli occhi con le forbici. </li><li> Utilizzare forbici e pinze per enucleare l&#39;occhio. </li><li> Luogo forbici sotto l&#39;occhio enucleato, tagliare il nervo ottico e dei tessuti circostanti e sollevare l&#39;occhio. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti conten...

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+clinical+applications+of+angiogenesis.">Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.</a> Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).</li><li>Staton, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+for+assaying+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).</li><li>Goodwin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+assays+of+angiogenesis+for+assessment+of+angiogenic+and+anti-angiogenic+agents.">In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents.</a> Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Fruttiger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+retinal+vasculature.">Development of the retinal vasculature.</a> Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. 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Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).</li><li>Lebrin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalidomide+stimulates+vessel+maturation+and+reduces+epistaxis+in+individuals+with+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia.">Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia.</a> Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).</li><li>Pi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connective+tissue+growth+factor+in+the+retinal+vasculature+during+development+and+ischemia.">Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).</li><li>Powner, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+gene+expression+in+whole+mouse+retina+by+in+situ+hybridization.">Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization.</a> Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).</li></ol>

Il metodo qui presentato offre un modo semplice ed efficace per ottenere immagini colorate preparativi monte intero di retine neonatali del mouse, il che rende un modello facilmente quantificabile e fisiologicamente rilevanti di angiogenesi. Inizialmente, l&#39;occhio del mouse può essere molto difficile da sezionare grazie alle sue piccole dimensioni e la forma globo, quindi sono necessarie una certa pratica e di buoni strumenti di dissezione per risultati affidabili. Dissezione di occhi preparati in 2x concentrazione...

L&#39;angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una &#39;punta&#39; cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali &#39;gambo&#39;. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una regione avascolare dove formano nuovi tubi vascolari. Al fine di stabilizzare questi tubi per sostenere il flusso di sangue, cellule endoteliali interagiscono con periciti e cellule muscolari lisce, che circondano i nuovi vasi sanguigni 1. Angiogenesi è essenziale per vascolarizzazione dell&#39;embrione e tessuti in crescita. Tuttavia, essa contribuisce anche a molti patologicodisturbi cal come il cancro; che difetti di angiogenesi sono associati a malattie ischemiche. Lo sviluppo di trattamenti farmacologici efficaci per regolare l&#39;angiogenesi come mezzo di trattamento malattia è quindi di grande interesse. Per esempio, efficaci fattori anti-angiogenici ridurranno la crescita del cancro, mentre strategie pro-angiogenici possono essere usati per trattare la malattia ischemica. Così, i modelli di angiogenesi sono essenziali per comprendere meglio la regolazione della formazione di nuovi vasi e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per migliorare o ridurre la crescita vascolare. Un elemento fondamentale della ricerca angiogenesi è la scelta di un modello appropriato vascolare. Molti modelli in vitro sono stati progettati per riprodurre i passi base dell&#39;angiogenesi come la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione e la sopravvivenza 2,3. Un frequentemente utilizzati saggio in vitro è la formazione di una rete ramificata di cellule endoteliali su una matrice in Matrigel, sebbene til suo non è specifico per le cellule endoteliali, né di solito incorporano il supporto di periciti o cellule muscolari lisce. Valutazione della ex vivo germinazione angiogenesi usando organo cultura mouse, ad esempio, il saggio corpo embrioide, il saggio anello aortico e il saggio metatarso fetale permette l&#39;analisi di angiogenesi delle cellule endoteliali nel contesto delle cellule di supporto aggiuntivi. Tuttavia, le limitazioni principali di questi saggi comprendono la mancanza di flusso di sangue e la regressione dei vasi nel tempo, dando una limitata finestra di analisi. Pertanto, per comprendere la regolazione dell&#39;angiogenesi, più precisamente, in modelli in vivo sono necessari come quelli sviluppati nel topo usando spugne impiantati sottocute o spine matrigel, così come il modello di ischemia dell&#39;arto posteriore. Tuttavia, questi modelli sono difficili da analizzare a causa della complessa architettura 3D del neovasi. In contrasto, l&#39;embrione zebrafish è dimostrato un modello eccellente per visualizzare angiogenesi in tuttamicrorganismo 4. Tuttavia, il topo è evolutivamente molto più strettamente correlato umano rispetto zebrafish, rendendo così il mouse un modello preferito in molti casi. Conseguentemente angiogenesi della retina topo postnatale rappresenta un metodo ben caratterizzato di scelta per la ricerca angiogenesi. Esso non solo fornisce un ambiente fisiologico, ma anche un 2D plesso vascolare che può essere facilmente visualizzato per mezzo di macchie fluorescenti appropriati. L&#39;architettura della rete nave, proliferazione endoteliale, crescita, reclutamento di cellule perivascolari e vaso rimodellamento possono tutti essere studiata utilizzando questa tecnica. Nella retina neonatale topo, lo sviluppo dei vasi retinici avviene nella prima settimana di vita postnatale. I topi, a differenza degli umani, nascono ciechi e le retine diventano solo vascolarizzato dopo la nascita. Vasi retinici nascono dal centro della retina vicino al nervo ottico al giorno postnatale 0 (P0), e si sviluppano da angiogenesi per formare un altamente organizzared plesso vascolare che raggiunge la periferia retinica di circa 5 P8. I vasi sanguigni si sviluppano in modo caratteristico con il plesso capillare gradualmente crescente verso l&#39;esterno del disco ottico verso la periferia per generare un normale modello di alternanza delle arterie e delle vene, con una rete capillare di intervenire. La vascolarizzazione della retina fornisce un modello ideale per studiare l&#39;angiogenesi come i vasi possono essere facilmente identificati come crescono in quello che è essenzialmente un piano 2D, rendendo così relativamente facile per esaminare la vascolarizzazione retinica nei preparati TV a montaggio 5. Un metodo per isolare il mouse retina neonatale per analisi delle risposte delle cellule endoteliali punta su diverse ore ex vivo è stato riportato 6. In alternativa, un esame più dettagliato di tutto il sistema vascolare della retina e marcatori vascolari associate richiede immunoistochimica di campioni di retina fisse a diversi stadi di sviluppo. Qui forniamouna descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per tutta la colorazione monte della retina murina plesso vascolare, dalla enucleazione iniziale dell&#39;occhio postnatale (vedere anche 7) attraverso i protocolli di colorazione per l&#39;imaging finale al microscopio.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pipettes 3 ml</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>PIP4210</td>
			<td>Remove tip with scissors to create a wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 24-well plates</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>353226</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Select Petri dishes TV 90 mm</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>SLS2002</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histobond slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0624</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 22 x 22 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-1336</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers #5</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501235</td>
			<td>Used for enucleation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips</td>
			<td>World precision instruments</td>
			<td>501778</td>
			<td>Used for dissecting retina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>crystal clear' tubes 2 ml</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1420-2000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>PBS reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Make up in 2x PBS and store at -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7638</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9663</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Vector</td>
			<td>S-1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold anti-fade reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21413</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4-alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>I21411</td>
			<td>Use at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Primary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NG2 (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5320</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB360</td>
			<td>Detects astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>04-585</td>
			<td>Detects pericytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>AB756P</td>
			<td>Detects vascular basement membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6198</td>
			<td>Detects vascular smooth muscle cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550546</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553370</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>550548</td>
			<td>Detects endothelial cell junctions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Alk1 (goat polyclonal)</td>
			<td>R&amp;D Systems</td>
			<td>AF770</td>
			<td>Detects endothelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Secondary Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11012</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11006</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11007</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse-Alexa488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat-Alexa594</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11058</td>
			<td>All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 &deg;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRc</td>
			<td>Camera for dissection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axioimager with Apotome</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axiocam HRm</td>
			<td>Camera for Axioimager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo

L&#39;angiogenesi è il complesso processo di formazione di nuovi vasi definito dalla germinazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi pre-esistente. Angiogenesi gioca un ruolo chiave non solo nel normale sviluppo di organi e tessuti, ma anche in molte malattie in cui la formazione del vaso sanguigno è disregolato, come il cancro, cecità e malattie ischemiche. Nella vita adulta, i vasi sanguigni sono generalmente quiescente così angiogenesi è un obiettivo importante per il romanzo lo sviluppo di farmaci per cercare di regolare la formazione di nuovi vasi specificamente nella malattia. Per capire meglio l&#39;angiogenesi e di sviluppare strategie appropriate per regolarlo, i modelli sono richieste che rispecchiano fedelmente le varie fasi biologiche che sono coinvolti. Il mouse retina neonatale fornisce un eccellente modello di angiogenesi perché arterie, vene e capillari sviluppano a formare un plesso vascolare durante la prima settimana dopo la nascita. Questo modello ha anche il vantaggio di avere un due dibidimensionale (2D) Struttura rendendo semplice analisi rispetto alla complessa anatomia 3D di altre reti vascolari. Analizzando la retina plesso vascolare in tempi diversi dopo la nascita, è possibile osservare le varie fasi della angiogenesi al microscopio. Questo articolo illustra una procedura semplice per analizzare il sistema vascolare di una retina di topo mediante colorazione fluorescente con anticorpi specifici isolectin e vascolari.

Dopo la dissezione della retina dovrebbe apparire come un fiore piatto (Figura 1). Utilizzando il protocollo, di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando isolectin colorazione B4-Alexa488 e sostenendo cellule muscolari vascolari sono visualizzati tramite actina muscolo liscio anti-alfa (Figura 2). La vista a bassa potenza usando un obiettivo 5X in figura 2 consente una visione d&#39;insieme dell&#39;organizzazione vascolare della retina. Inoltr...

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Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell&#39;angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l&#39;angiogenesi in un<em&gt; In vivo</em&gt; Contesto. Immunofluorescenza per visualizzare con precisione il plesso vascolare è fondamentale per il successo di questo tipo di studi.

Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Research

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