Name: improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

עבודה זו מומנה בחלקו על ידי BBSRC (BB/1006478/1). PRR הוא הנמען של אוניברסיטת חברה מלכותית מלגת מחקר.

1. שיקולים אסטרטגיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבחירה של זרע גבישים המשמשת לניסויי microseeding תשתנה בהתאם למטרת הניסוי. בתחילת פרויקט כדאי למצוא כמה להיטי התגבשות שיכולה לספק נקודות התחלה חלופיות לגביש אופטימיזציה. rMMS מקטין באופן משמעותי את הצור?...

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

במאמר זה שתארנו שיטה כללית להקרנת התגבשות חלבון rMMS. אנחנו הוכיחו באמצעות שני חלבוני מבחן שיפור משמעותי בשיעור הצלחה גיבוש בשיטה זו. ניתוח עקיפה באמצעות קרינת סינכרוטרון של קבוצת משנה של גבישים שנוצרו באמצעות rMMS ושיטות שאינם rMMS חשף וריאציה מעט באיכות עקיפה בין הגביש?...

מהיישום לראשונה שלה על ידי פרוץ, Kendrew ועמיתים לעבודה בקביעת המבנים של המוגלובין ומיוגלובין, לצינורות אוטומטיים המודרניים תפוקה גבוהה של קונסורציומים גנומיקה המבניים, קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן macromolecular העניקה לנו הצצה מבנית חסרת תקדים אל עולם החלבון . טכניקה זו עדיין השיטה הניסיונית ביותר ישימה נרחב המאפשרת הדמיה הישירה של מבנה חלבון באטומי, או בסמוך לרזולוציה אטומית (כלומר בטווח Å 1-3). תנאי מוקדם לרנטגן עקיפה שיחול על חלבון הוא שזה חייב להיות ראשון התגבש, וזה בשלב זה של התהליך שנשאר צעד אחד הגדול שער הגבלה בקביעת מבנה בשיטות עקיפה 1, 2. למרות התקדמות משמעותית בהבנתנו את התהליך של התגבשות חלבון, ושיפורים משמעותיים באיכות והזמינות של מסכים התגבשות,מגשים, וטכנולוגיות קשורות, הוא נשאר בלתי אפשרי לחזות את הסבירות של התגבשות הצלחה 3 באופן מהימן. ניתן ליישם שיטות ביוכימיות וbiophysical להעריך אם חלבון של מציג עניין מאפיינים נוחים להתגרענות גביש וצמיחה, כלומר הוא זה מקופל היטב, הומוגנית, monodisperse, וכו &#39;, לעומת זאת, תובנות אלו בשום אופן לא מספקות מנבא סופי של גיבוש נטייה. זריעה כבר התיימרה ארוכה להיות שיטה מעשית לשיפור במספר, הגודל והאיכות של גבישים קיימים או חומר גבישי 4-7. גישה זו מבוססת על ההנחה שתנאים שתומכים בהתגרענות גביש לא יכולים להיות אופטימליים לגידול גבישים שלאחר מכן ולהיפך. על ידי העברת חומר גרעיני ממצב אחד למשנו, אפשר לנסות לנתק ביעילות תהליכים אלה, גישה ובכך נותנת למרחב חדש, שעדיין לא נחקר התגבשות,וכתוצאה מכך להגדיל את שיעור ההצלחה הכולל של ניסוי הקרנה. שיטות הוקמו תועדו לmacroseeding (i), ההעברה של גביש יחיד בשלמותו ממצב אחד לעוד 8, (ii) זריעת פס, העברת חומר גרעיני, בדרך כלל מתקבל על ידי הפעלת לחץ כיוונית באמצעות למשל השפם של חתול אל פני השטח של גביש קיים, ואחרי המעבר הבא של הזיף דרך טיפה חדשה התגבשות 9, וכן (iii) microseeding &quot;קלאסי&quot;, ההעברה של &quot;זרעים&quot; קריסטל, שנוצרו על ידי קצירה כתוש גבישים (או גבישים חומר), לתנאים דומים לאלה שהניבו את הזרעים 10. יש לציין את כל שלושת שיטות אלה הם זמן רב וגרוע להרחבה, בוודאי בהשוואה למה שהוא בר השגה עם רובוטיקה התגבשות טיפול הנוזל המודרנית. גורמים אלה תרמו, ברמה מסוימת לפחות, לתפיסה שזרעing הוא שיטה לביקורים רק כאשר גישות אחרות נכשלו לשאת פרי. microseeding מטריצה ​​אקראית (rMMS) הוא חידוש המתודולוגי האחרון המשלב את היתרונות של microseeding המסורתי עם אלו של הקרנת תפוקה גבוהה ויכולת רחבה 11-13. גישה זו מסתמכת על הדור של מניית זרע, המיוצר מחומר גבישים גרעיני, אשר עשוי להיות aliquoted ל/ על כל sub-well/coverslip בתוך מסך התגבשות 96 מצב סטנדרטי. שיטה זו ישימה גם בישיבה או בתליית ניסויי דיפוזיה אדי טיפה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב24 גם או בפורמט מגש 96 היטב. rMMS הודגם בניסוי כדי להגדיל באופן משמעותי את שיעור הצלחה של התגבשות, ולייצר גבישים באיכות עקיפה גדולה יותר וכמות 11, 13, 14, ומייצג כלי חדשני בארסנל &quot;crystallographers של גישות בoNgoing מאמץ לקראת הצלחה התגבשות. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS ולספק נתונים לדוגמה הממחישים את היעילות של טכניקה זו.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

הקרנה אקראית מטריצת microseed (rMMS) היא טכניקת התגבשות חלבון שבו גבישי זרע מתווספים למסכים אקראיים. על ידי הגדלת הסבירות כי גבישים יגדלו באזור metastable של דיאגראמת הפאזות של חלבון, מוביל התגבשות נוסף לעתים קרובות מתקבל, את האיכות של גבישים המיוצרים עשויה להיות מוגברת, ואספקה ​​טובה של גבישים לניסויי איסוף נתונים ושרייה מסופקת. כאן אנו מתארים שיטה כללית לrMMS שניתן להחיל גם ניסויים יושבים טיפה או תליית אדי ירידת דיפוזיה, שהוקמו ביד או באמצעות רובוטיקה טיפול נוזל, ב96 היטב או בתבנית מגש 24 גם.

(א) דוגמא לניסוי rMMS כדי להדגים את האפקטיביות של הקרנת rMMS אנחנו מוחלים בשיטה זו כדי ההתגבשות של ליזוזים ביצת תרנגולת הלבן (HEWL) וכבד שור קטלאז (BLC). שני אנזימים אלה הם crystallizable בהחלט ומבניים מאופיינים היטב מטרות 15, 16. ככזה גם לספק נב...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

כאן אנו מתארים שיטה כללית להקרנת מטריצת microseed אקראית. טכניקה זו מוצגת להגדיל באופן משמעותי את שיעור ההצלחה של ניסויי הקרנת התגבשות חלבון, להפחית את הצורך באופטימיזציה, ולספק אספקה ​​אמינה של גבישים לאיסוף נתונים וניסויים יגנד שרייה.

שיפור שיעור ההצלחה של התגבשות חלבון על ידי Microseed מטריקס אקראי הקרנה

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

באמצעות מערכת GELFREE 8100 ההיפוך חלוקה על ההיפוך חלוקה משקל מבוסס מולקולרית עם שלב החילוץ נוזלי

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

גילוי Metalloproteinases מטריקס פונקציונלית על ידי Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

התגבשות של חלבונים בממברנה ב Mesophases Lipidic

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

הכנה של חלבון רקומבינציה Mgm101 ידי אסטרטגיה תיוג מבוססת MBP

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

הקרנת הגנום כל חלבונים אינטראקציה ידי חלבון-בר השלמה Assay (PCA) בתאים חיים

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...