Name: improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00
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इस काम बीबीएसआरसी (BB/1006478/1) के हिस्से में वित्त पोषित किया गया. PRR एक रॉयल सोसाइटी यूनिवर्सिटी रिसर्च फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है.

1. सामरिक संबंधी बातें <ol><li> microseeding प्रयोगों के लिए इस्तेमाल बीज क्रिस्टल के चुनाव को प्रयोग करने के उद्देश्य के आधार पर अलग अलग होंगे. एक परियोजना की शुरुआत में यह क्रिस्टल अनुकूलन के लिए वैकल्पिक शुरू अं?...

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

इस पत्र में हम rMMS प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन किया है. हम इस पद्धति का उपयोग करके दो परीक्षण प्रोटीन क्रिस्टलीकरण सफलता दर में उल्लेखनीय वृद्धि का उपयोग कर दिखा दिय?...

Perutz, Kendrew और स्ट्रक्चरल जीनोमिक्स कंसोर्टियम के आधुनिक उच्च throughput स्वचालित पाइपलाइनों को, हीमोग्लोबिन और myoglobin की संरचनाओं के निर्धारण में सह कार्यकर्ताओं द्वारा अपने प्रारंभिक आवेदन से macromolecular एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी हमें प्रोटीन की दुनिया में एक अभूतपूर्व संरचनात्मक झलक चाहता है . इस तकनीक को परमाणु में प्रोटीन संरचना के प्रत्यक्ष दृश्य परमिट कि सबसे व्यापक रूप से लागू प्रयोगात्मक विधि रहता है, या (यानी 1-3 एक रेंज में) परमाणु प्रस्ताव पास. एक प्रोटीन को लागू करने के लिए एक्स - रे विवर्तन के लिए एक शर्त यह पहला सघन किया जाना चाहिए, और यह विवर्तन तरीके 1, 2 द्वारा संरचना निर्धारण में सबसे बड़ा एकल दर सीमित कदम बनी हुई है कि इस प्रक्रिया के इस चरण में है. हमारे प्रोटीन crystallization की प्रक्रिया की समझ, और क्रिस्टलीकरण स्क्रीन की गुणवत्ता और उपलब्धता में प्रमुख सुधारों में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद,ट्रे, और संबंधित तकनीकों, यह मज़बूती से क्रिस्टलीकरण सफलता 3 की संभावना की भविष्यवाणी करना असंभव बना हुआ है. बायोकेमिकल और biophysical तरीकों रुचि प्रदर्शित की एक प्रोटीन क्रिस्टल nucleation और विकास के लिए अनुकूल लक्षण है, यानी यह अच्छी तरह से मुड़ा हुआ, सजातीय, monodisperse, आदि है कि आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन कोई रास्ता नहीं में इन अंतर्दृष्टि क्रिस्टलीकरण की एक निश्चित कारक प्रदान प्रवृत्ति. सीडिंग लंबे मौजूदा क्रिस्टल या क्रिस्टलीय पदार्थ 4-7 की संख्या, आकार, और गुणवत्ता में सुधार लाने के लिए एक व्यावहारिक तरीका हो कथित किया गया है. यह दृष्टिकोण क्रिस्टल nucleation का समर्थन करता है एक शर्त है कि बाद में क्रिस्टल विकास और इसके विपरीत के लिए इष्टतम नहीं हो सकता कि इस तथ्य पर आधारित है. दूसरे के लिए एक शर्त से nucleated सामग्री के हस्तांतरण से, एक,, प्रभावी ढंग से इन प्रक्रियाओं दसगुणा करने के लिए नए, के रूप में अभी तक बेरोज़गार क्रिस्टलीकरण अंतरिक्ष करने के लिए इस प्रकार देने का उपयोग करने का प्रयास हो सकता हैऔर एक परिणाम के रूप में एक स्क्रीनिंग प्रयोग के समग्र सफलता की दर बढ़ रही है. स्थापित तरीकों आम तौर पर उदाहरण के लिए उपयोग कर दिशात्मक दबाव के आवेदन के द्वारा प्राप्त (मैं) macroseeding, एक और 8 के लिए एक शर्त से अपनी संपूर्णता में एक एकल क्रिस्टल का हस्तांतरण, (द्वितीय) लकीर बोने, nucleated सामग्री के हस्तांतरण के लिए दर्ज किया गया है एक नए क्रिस्टलीकरण बूंद 9, और (iii) &quot;शास्त्रीय&quot; microseeding के माध्यम से गलमुच्छा के बाद पारित होने के द्वारा पीछा एक मौजूदा क्रिस्टल, की सतह के लिए एक बिल्ली गलमुच्छा, कटाई से उत्पन्न क्रिस्टल &quot;बीज&quot;, के स्थानांतरण कण (या क्रिस्टलीय कुचल बीज 10 झुकेंगे कि उन लोगों के लिए इसी तरह की परिस्थितियों में सामग्री),. उल्लेखनीय है कि इन तरीकों के सभी तीन निश्चित रूप से आधुनिक तरल से निपटने क्रिस्टलीकरण रोबोटिक्स के साथ प्राप्त है क्या की तुलना में, समय लेने वाली और खराब स्केलेबल हैं. इन कारकों धारणा को, कम से कम कुछ स्तर पर, योगदान दिया है कि बीजआईएनजी अन्य दृष्टिकोण फल सहन करने में विफल रहा है जब केवल दौरा किया जा करने के लिए एक विधि है. रैंडम मैट्रिक्स microseeding (rMMS) उच्च throughput प्रदर्शन और scalability 11-13 के लोगों के साथ पारंपरिक microseeding के लाभों को जोड़ती है कि हाल ही में एक पद्धति नवीनता है. यह दृष्टिकोण एक मानक 96 हालत क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के भीतर प्रत्येक sub-well/coverslip पर / में aliquoted किया जा सकता है जो nucleated क्रिस्टलीय पदार्थ, से उत्पादित बीज स्टॉक की पीढ़ी पर निर्भर करता है. इस विधि दोनों हाथ से या 24 अच्छी तरह से या 96 अच्छी तरह से ट्रे प्रारूप में, तरल से निपटने रोबोटिक्स का उपयोग कर या तो स्थापित ड्रॉप वाष्प प्रसार प्रयोगों, बैठे या फांसी के लिए लागू है. rMMS काफी क्रिस्टलीकरण सफलता की दर में वृद्धि, और अधिक से अधिक विवर्तन गुणवत्ता और मात्रा के 11, 13, 14 के क्रिस्टल का उत्पादन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रदर्शन किया, और ओ में दृष्टिकोण की crystallographers &#39;शस्त्रागार में एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व कर दिया गया हैक्रिस्टलीकरण सफलता की दिशा में प्रयास Ngoing. यहाँ हम rMMS के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन है और इस तकनीक के प्रभाव illustrating नमूना डेटा प्रदान करते हैं.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

रैंडम microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग (rMMS) बीज क्रिस्टल यादृच्छिक स्क्रीन करने के लिए जोड़ रहे हैं, जिसमें एक प्रोटीन crystallization तकनीक है. क्रिस्टल एक प्रोटीन के चरण आरेख की metastable क्षेत्र में विकसित होगा कि संभावना में वृद्धि करके, अतिरिक्त क्रिस्टलीकरण सुराग अक्सर उत्पादित क्रिस्टल की गुणवत्ता वृद्धि हो सकती है, प्राप्त कर रहे हैं, और डेटा संग्रह और भिगोने प्रयोगों के लिए क्रिस्टल का एक अच्छा आपूर्ति प्रदान की जाती है. यहाँ हम हाथ से या 96 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से ट्रे प्रारूप में, तरल से निपटने रोबोटिक्स का उपयोग कर या तो स्थापित बूंद बैठे या फांसी ड्रॉप वाष्प प्रसार प्रयोगों, या तो के लिए लागू किया जा सकता है कि rMMS के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन.

एक rMMS प्रयोग की (ए) उदाहरण RMMS स्क्रीनिंग के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए हम मुर्गी अंडे का सफेद लाइसोजाइम (HEWL) और गोजातीय जिगर Catalase (BLC) के क्रिस्टलीकरण के लिए इस पद्धति लागू होता है. इन एंजाइमों ख?...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

यहाँ हम यादृच्छिक microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग के लिए एक सामान्य विधि का वर्णन. यह तकनीक काफी, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण स्क्रीनिंग प्रयोगों की सफलता दर को बढ़ाने के अनुकूलन के लिए की जरूरत को कम, और डेटा संग्रह और ligand-भिगोने प्रयोगों के लिए क्रिस्टल की एक विश्वसनीय आपूर्ति प्रदान करने के लिए दिखाया गया है.

रैंडम Microseed मैट्रिक्स स्क्रीनिंग द्वारा प्रोटीन crystallization की सफलता की दर में सुधार

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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