Name: improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato in parte dalla BBSRC (BB/1006478/1). PRR è il destinatario di un Royal Society University Research Fellowship.

1. Considerazioni strategiche <ol><li> La scelta di semi-cristalli utilizzato per esperimenti microseeding varierà a seconda dell&#39;obiettivo dell&#39;esperimento. All&#39;inizio di un progetto è utile per trovare diversi colpi di cristallizzazione che possono fornire punti di partenza alternativi per l&#39;ottimizzazione di cristallo. RMM riduce notevolmente la necessità di ottimizzazione cristallo perché i cristalli di buona qualità hanno maggiori probabilità di crescere nella zona metastabile del diagramma ...

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

In questo articolo abbiamo descritto un metodo generale per lo screening RMM la cristallizzazione della proteina. Abbiamo dimostrato con due proteine ​​di prova di un aumento significativo nel tasso di successo di cristallizzazione con questo metodo. Analisi di diffrazione con radiazione di sincrotrone di un sottoinsieme di cristalli generati utilizzando RMM e metodi non RMM rivelato piccola variazione nella qualità di diffrazione tra i cristalli coltivati ​​utilizzando entrambi i metodi, anche se gli autori pr...

Dalla sua domanda iniziale da Perutz, Kendrew e collaboratori nel determinare le strutture di emoglobina e mioglobina, ai moderni ad alto rendimento condotte automatizzati di genomica strutturale consorzi, macromolecolare cristallografia a raggi X ci ha offerto uno scorcio strutturale senza precedenti nel mondo della proteina . Questa tecnica rimane il metodo sperimentale più ampiamente applicabile che permette la visualizzazione diretta della struttura delle proteine ​​a atomico, o vicino risoluzione atomica (cioè nell&#39;intervallo 1-3 Å). Un prerequisito per diffrazione di raggi X da applicare a una proteina è che deve prima essere cristallizzato, ed è questa fase del processo che resta il solo grande fattore limitante nella determinazione della struttura con metodi di diffrazione 1, 2. Nonostante i significativi progressi nella nostra comprensione del processo di cristallizzazione delle proteine, e notevoli miglioramenti nella qualità e disponibilità di schermi di cristallizzazione,vassoi e tecnologie correlate, resta impossibile prevedere in modo affidabile la probabilità di successo di cristallizzazione 3. Metodi biochimici e biofisici possono essere applicati per valutare se una proteina di interesse display caratteristiche favorevoli per la nucleazione e la crescita di cristallo, cioè è ben piegato, omogenea, monodisperse, ecc, tuttavia, queste intuizioni in alcun modo fornire un predittore definitiva di cristallizzazione propensione. Seeding è stato a lungo preteso di essere un metodo praticabile per migliorare il numero, le dimensioni e la qualità dei cristalli esistenti o di materiale cristallino 4-7. Questo approccio si basa sul presupposto che una condizione che supporta cristallo nucleazione può non essere ottimale per la successiva crescita di cristalli e viceversa. Trasferendo materiale nucleate da una condizione all&#39;altra, si può tentare di disaccoppiare efficacemente questi processi, dando così l&#39;accesso al nuovo, ancora inesplorate spazio cristallizzazione,e di conseguenza aumentare il tasso di successo di un esperimento di screening. Metodi stabiliti sono stati documentati per (i) macroseeding, il trasferimento di un singolo cristallo in toto da una condizione all&#39;altra 8, (ii) realizzato semina, il trasferimento di materiale nucleati, generalmente ottenuta mediante l&#39;applicazione di pressione direzionale utilizzando ad esempio baffo di un gatto alla superficie di un cristallo esistente, seguita da successivo passaggio del baffo attraverso una nuova cristallizzazione goccia 9, e (iii) microseeding &quot;classico&quot;, il trasferimento di cristallo &quot;semi&quot;, generati dalla raccolta schiacciato cristalli (o cristallina materiale), in condizioni analoghe a quelle che hanno dato i semi 10. In particolare tutti e tre questi metodi sono molto tempo e poco scalabile, certamente in confronto a ciò che è realizzabile con le moderne di gestione dei liquidi robotica cristallizzazione. Questi fattori hanno contribuito, in qualche modo, almeno, alla percezione che le sementiing è un metodo di essere visitato solo quando altri metodi non sono riusciti a dare i suoi frutti. Microseeding matrice casuale (RMM) è una innovazione metodologica recente che combina i vantaggi di microseeding tradizionale con quelle di screening ad alto rendimento e scalabilità 11-13. Questo approccio si basa sulla generazione di un archivio di sementi, prodotti a partire da materiale cristallino nucleate, che può essere frazionato in / su ciascun sub-well/coverslip all&#39;interno di uno schermo di cristallizzazione 96-condizione standard. Questo metodo è applicabile sia seduto o appendere esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 96-ben 24 pozzetti o. RMM è stato dimostrato sperimentalmente per aumentare significativamente il tasso di successo di cristallizzazione, e produrre cristalli di una maggiore qualità e quantità 11, 13, 14 di diffrazione, e rappresenta uno strumento innovativo nell&#39;arsenale dei cristallografi &#39;di approcci in ongoing sforzo verso il successo cristallizzazione. Qui si descrive un metodo generale per RMM e fornire dati di esempio che illustrano l&#39;efficacia di questa tecnica.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Lo screening matrice microseed casuale (RMM) è una tecnica di cristallizzazione della proteina in cui cristalli di semi vengono aggiunti agli schermi casuali. Aumentando la probabilità che i cristalli crescono nella zona metastabile del diagramma di fase di una proteina, contatti supplementari cristallizzazione si ottengono spesso, la qualità dei cristalli prodotti può essere aumentata, e una buona scorta di cristalli per esperimenti di raccolta dati e da bagno sono forniti. Qui si descrive un metodo generale per RMM che possono essere applicati a entrambi seduti goccia o appesi esperimenti di diffusione di vapori goccia, stabiliti a mano o utilizzando la robotica di manipolazione dei liquidi, in formato vassoio 24-ben 96 pozzetti o.

(A) Esempio di un esperimento RMM Per dimostrare l&#39;efficacia dello screening RMM abbiamo applicato questo metodo per la cristallizzazione di gallina albume lisozima (HEWL) e del fegato bovino catalasi (BLC). Entrambi questi enzimi sono eminentemente cristallizzabile e sono strutturalmente obiettivi 15, 16 ben caratterizzati. Come tale entrambi forniscono ottimi soggetti di prova con cui illustrare il tasso di successo di cristallizzazione maggiore ottenibile con RMM. Esperimenti ...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Qui si descrive un metodo generale per lo screening matrice microseed casuale. Questa tecnica è indicata per aumentare in modo significativo il tasso di successo di cristallizzazione della proteina esperimenti di screening, ridurre la necessità di ottimizzazione, e di fornire un approvvigionamento affidabile di cristalli per la raccolta di dati ed esperimenti ligando-ammollo.

Migliorare il tasso di successo di cristallizzazione della proteina da Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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