Name: improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00
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この作品は、BBSRC（BB/1006478/1）によって部分的に資金を供給された。 PRRは王立協会大学研究フェローシップ受賞。

1。戦略的な考慮事項<ol><li> microseeding実験のために使用するシード結晶の選択は、実験の目的に依存して変化する。プロジェクトの開始時に、結晶の最適化のための代替出発点を提供することができるいくつかの結晶化ヒットを見つけることは有用である。良好な品質の結晶が乱れ、すなわち以下または平衡システムに戻る核生成領域において、相図の準安定域で成長する可能性が高...

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

本論文では、リスク管理措置のタンパク質結晶化スクリーニングのための一般的な方法を記載している。我々は、このメソッドを使用して、2つの試験タンパク質の結晶化の成功率の著しい増強を用いて実証した。リスク管理措置及び非リスク管理措置法を用いて作製した結晶のサブセットの放射光を用いた回折分析は、以前の著者らは良質の結晶がRMMS実験11で増殖する可能?...

ヘモグロビンやミオグロビンの構造を決定する上でペールツ、ケンドルーとその共同研究者によって、その最初の適用から、構造ゲノムコンソーシアムのパイプラインを自動化された現代的なハイスループットに、巨大分子のX線結晶学は私たちに、タンパク質の世界に前例のない構造的な姿を与えている。この技術では、原子、または原子レベルの分解能（ すなわち、1〜3Åの範囲）付近のタンパク質構造の直接的な可視化を可能にする最も広く適用できる実験方法のままである。タンパク質に適用されるX線回折の前提条件は、それが最初に結晶化されなければならないことであり、それは回折法1、2による構造決定における唯一最大の律速段階のままプロセスのこの段階である。タンパク質結晶化の過程の理解が大幅に進歩し、結晶化スクリーンの品質と可用性の大幅な改善にもかかわらず、トレイ、および関連技術は、確実に、結晶化の成功3の可能性を予測することは不可能のままである。生化学的および生物物理学的方法は、対象ディスプレイのタンパク質が結晶核生成と成長のための良好な特性、 すなわち、それがうまく折り、均質な単分散などであるかどうかを評価するために適用することができる、しかし、決して、これらの知見は、結晶化の決定的な予測を提供傾向。 播種は、既存の長い結晶または結晶性物質4-7の数、サイズ、及び品質を向上させるための実行可能な方法であることが主張されている。このアプローチは、結晶核形成を支持する状態が続く結晶成長およびその逆のために最適ではないかもしれないことを前提としている。別の状態から核物質を転送することによって、人はまだ未踏の結晶空間として、このように新たにアクセスを与え、効果的にこれらのプロセスを分離しようとする場合があり、その結果、スクリーニング実験の全体​​的な成功率を増加させる。確立された方法は、（i）マクロシーディング、別の8 1つの状態から、その全体が単結晶の転写、一般に、例えばした指向性圧力を加えることによって得られた（ii）のストリークシーディング、核物質の移動のために文書化されている猫の新しい結晶化ドロップ9を介してウィスカの後続の通過に続いて、既存の結晶の表面にウィスカ、および（iii）「古典的な」microseedingは、収穫することによって生成された結晶を「シード」の移動は、結晶（または結晶を砕いシード10をもたらしたものと同様の条件への材料）、。注目すべきことに、これらの方法の3つのすべては、確かに近代的な液体処理結晶化ロボットを用いて達成可能であるものと比較して、時間がかかり、不十分スケーラブルです。これらの要因は、その種子知覚に、少なくともいくつかのレベルで、貢献してきましたINGは他のアプローチが実を結ぶことができなかった場合にのみ訪問する方法である。 ランダム行列microseeding（リスク管理措置）は、ハイスループットスクリーニングとスケーラビリティ11月13日のものと伝統的なmicroseedingの利点を組み合わせた最新の方法論的革新です。このアプローチは、標準的な96の条件結晶化画面内の各sub-well/coverslip /上に分注しことが有核結晶質材料から製造シードストックの生成に依存している。この方法は、手動で、または24ウェルまたは96ウェルトレイ形式の液体取り扱いロボットを用いて、いずれかの確立されたドロップ蒸気拡散実験を、座ったりハングの両方に適用可能である。リスク管理措置が大幅に結晶化の成功率を高め、より大きな回折品質および量11、13、14の結晶を生成するために実験的に証明、およびoにおけるアプローチの結晶学者&#39;武器の中で革新的なツールを表すされている結晶化の成功に向けて努力をngoing。ここでは、リスク管理措置のための一般的な方法を説明し、この技術の有効性を示すサンプルデータを提供する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

ランダムmicroseedマトリックススクリーニング（リスク管理措置）は、種結晶をランダム画面に付加されたタンパク質結晶化技術である。結晶は、タンパク質の相図の準安定域で成長し、余分な結晶化リードがしばしば得られる可能性を増加させることにより、製造された結晶の品質を向上させることができ、データ収集および浸漬実験のために、結晶の十分な供給が提供される。ここでは、手または96ウェルまたは24ウェルトレイ形式で、液体ハンドリングロボットを用いてのいずれか確立シッティングドロップまたはハンギングドロップ蒸気拡散実験のいずれかに適用することができるリスク管理措置のための一般的な方法を記載している。

RMMS実験の（A）実施例リスク管理措置のスクリーニングの有効性を実証するために、我々はニワトリ卵白リゾチーム（HEWL）およびウシ肝臓カタラーゼ（BLC）の結晶化にこの方法を適用する。これらの酵素は極めて結晶性であり、構造的によくターゲット15,16の両方を特徴とする。このような両方のリスク管理措置で達成可能な強化された結晶化の成功率を説明する?...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

ここでは、ランダムmicroseedマトリックススクリーニングのための一般的方法を記載する。この技術は、有意に、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を高める最適化の必要性を低減し、データ収集およびリガンド浸漬実験の結晶の安定供給を提供することが示されている。

ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Research

JoVE Journal

Biology

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電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

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X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

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Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

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Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

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Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

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生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

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膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...