Name: improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert delvis av BBSRC (BB/1006478/1). PRR er mottaker av en Royal Society University Research Fellowship.

En. Strategiske hensyn <ol><li> Valget av seed-krystaller benyttes til microseeding eksperimenter vil variere avhengig av formålet med eksperimentet. I begynnelsen av et prosjekt er det nyttig å finne flere krystallisering treff som kan gi alternative utgangspunkter for krystall optimalisering. RMM reduserer behovet for krystall optimalisering fordi god kvalitet krystaller er mer sannsynlig å vokse i den metasone av fasediagrammet, dvs. i det området der følgende forstyrrelse eller Nukleasjon systemet g?...

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

I denne artikkelen har vi beskrevet en generell metode for RMM protein krystallisering screening. Vi har vist ved å bruke to test proteinene en signifikant forbedring i krystallisering suksessrate ved bruk av denne metoden. Diffraksjon analyse ved hjelp av synkrotronstråling av en undergruppe av krystaller generert ved hjelp av RMM og ikke-RMM metoder avslørte lite variasjon i diffraksjon kvalitet mellom krystaller vokst med begge metoder, selv om tidligere forfattere har rapportert at god kvalitet krystaller er mer ...

Fra sin første søknad etter Perutz, Kendrew og medarbeidere i å bestemme strukturene av hemoglobin og myoglobin, til de moderne high throughput automatiserte rørledninger fra strukturelle genomikk konsortier, har makromolekylært røntgenkrystallografi gitt oss en enestående strukturell glimt inn i protein verden . Denne teknikken er fortsatt den mest allment gjeldende eksperimentell metode som tillater direkte visualisering av proteinstruktur på atom, eller i nærheten av atom-oppløsning (dvs i 1-3 et område). En forutsetning for røntgendiffraksjon som skal anvendes på et protein, er at det må først bli krystallisert, og det er denne fasen av prosessen som forblir den største hastighetsbegrensende trinn i strukturbestemmelse etter diffraksjonsmetoder 1, 2. Til tross for betydelige fremskritt i forståelsen av prosessen med protein krystallisering, og store forbedringer i kvalitet og tilgjengeligheten av krystallisering skjermerskuffer og relaterte teknologier, er det fortsatt umulig å sikkert forutsi sannsynligheten for krystallisering suksess tre. Biokjemiske og biofysiske metoder kan bli anvendt for å vurdere hvorvidt et protein av interesse viser gunstige egenskaper til krystallkjernedannelse og vekst, dvs. at det er vel-foldet, homogen, monodisperse, etc., men denne informasjonen ikke på noen måte å gi en endelig prediktor for krystallisering tilbøyelighet. Såing har lenge vært påstått å være en levedyktig metode for å forbedre antall, størrelse og kvalitet av eksisterende krystaller eller krystallinske materiale 4-7. Denne fremgangsmåten er basert på den forutsetning at en tilstand som støtter krystallkjernedannelse ikke kan bli optimal for påfølgende krystallvekst, og vice versa. Ved å overføre kjerneholdige materialet fra en tilstand til en annen, kan man forsøke å effektivt kople disse prosessene, og dermed gi tilgang til nye, som ennå uutforsket krystallisering plass,og som et resultat å øke den samlede suksessrate på en screening eksperiment. Etablerte fremgangsmåter er blitt dokumentert for (i) macroseeding, overføring av en enkelt krystall i sin helhet fra en tilstand til en annen 8, (ii) strek såing, overføring av kjerneholdige materiale, vanligvis oppnådd ved anvendelse av retningsbestemt trykk ved bruk av f.eks en katt whisker til overflaten av et eksisterende krystaller, etterfulgt av etterfølgende passasje av whisker gjennom en ny krystallisering dråpe 9, og (iii) &quot;klassiske&quot; microseeding, overføring av krystall &quot;frø&quot;, generert ved å høste knust krystaller (eller krystallinsk materiale), i forhold som ligner de som ga frøene 10.. Spesielt alle disse tre metodene er tidkrevende og dårlig skalerbar, i hvert fall i forhold til hva som er oppnåelig med moderne væskehåndtering krystallisering robotikk. Disse faktorene har bidratt, på noen nivå minst, til en oppfatning av at frøeting er en metode som skal besøkes kun når andre tilnærminger har ikke klart å bære frukter. Tilfeldig matrise microseeding (RMM) er en fersk metodisk innovasjon som kombinerer fordelene ved tradisjonell microseeding med de av høy gjennomstrømming screening og skalerbarhet 11-13. Denne fremgangsmåten er avhengig av dannelsen av et frø lager, produsert fra kjerneholdige krystallinske materiale, som kan deles opp i porsjoner / på hver sub-well/coverslip i en standard 96-tilstand krystallisering skjerm. Denne metoden gjelder for både sittende eller hengende dråpe dampdiffusjon eksperimenter, etablert enten for hånd eller ved hjelp av væskebehandlings robotikk, i 24-brønn eller 96-brønns skuffen format. RMM er påvist eksperimentelt til en betydelig økning krystallisering suksessrate, og produsere krystaller av større diffraksjon kvalitet og kvantitet 11, 13, 14, og representerer et nyskapende verktøy i Krystallo &#39;arsenal av tilnærminger i ongoing innsats mot krystallisering suksess. Her beskriver vi en generell metode for RMM og gi prøvedata som illustrerer effektiviteten av denne teknikk.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Tilfeldig microseed matrise screening (RMM) er et protein krystallisering teknikk der kimkrystallene legges til tilfeldige skjermer. Ved å øke sannsynligheten for at krystallene vokser i den metastabile sone for et protein som er fasediagrammet, er ekstra krystallisering fører ofte oppnås, og kvaliteten av krystaller dannes, kan økes, og en god tilførsel av krystaller for datainnsamlings-og avslapnings eksperimenter er gitt. Her beskriver vi en generell metode for RMM som kan brukes til enten sittende dråpe eller hengende dråpe dampdiffusjon eksperimenter, etablert enten for hånd eller ved hjelp av væskebehandlings robotikk, i 96-brønn eller 24-brønns skuffen format.

(A) Eksempel på en RMM eksperiment For å demonstrere effektiviteten av RMM screening vi anvendt denne metode til krystallisering av hen eggehvite lysozym (HEWL) og bovin lever katalase (BLC). Begge disse enzymene er utpreget krystalliserbar og er strukturelt godt karakterisert målene 15, 16. Som sådan både gi gode test fag som skal illustrere den forbedrede krystallisering suksessrate oppnåelig med RMM. Krystallisering eksperimenter ble etablert i 96-vel sittende dråpe skuffen...

Watch this Scientific Journal Video about Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening at JoVE.com

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Her beskriver vi en generell metode for tilfeldig microseed matrise screening. Denne teknikken er vist å signifikant øke suksessraten av protein krystallisering screening eksperimenter, redusere behovet for optimalisering, og gir en pålitelig forsyning av krystaller for datainnsamling og ligand-avslapnings eksperimenter.

Forbedre suksessrate på Protein Krystallisering av Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Research

JoVE Journal

Biology

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

High-throughput krystallisering av membran proteiner Bruke Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

Tilberedning av Mgm101 rekombinasjon Protein av MBP-baserte Tagging Strategi

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Genome-wide Protein-protein Interaksjon Screening av Protein-fragment Komplemente analyse (PCA) i levende celler

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

Grønn Fluorescent Protein-baserte Expression Screening av membran proteiner i<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...