Name: improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening
Uploaded: 2013-08-31T10:00:00
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Este trabalho foi financiado em parte pelo BBSRC (BB/1006478/1). PRR é o destinatário de uma Bolsa de Investigação da Universidade Royal Society.

1. Considerações Estratégicas <ol><li> A escolha de uma semente de cristais utilizados para experiências microdispersão irá variar, dependendo do objetivo do ensaio. No início de um projeto é útil para encontrar vários hits de cristalização que podem fornecer pontos de partida alternativos para otimização de cristal. MGR reduz significativamente a necessidade de otimização de cristal porque cristais de boa qualidade são mais propensos a crescer na zona metaestável do diagrama de fases, ou seja,</...

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

Neste artigo descrevemos um método geral para MGR proteína triagem cristalização. Nós demonstramos usando duas proteínas de teste uma melhoria significativa na taxa de sucesso de cristalização utilizando este método. Análise de difração usando radiação síncrotron de um subconjunto de cristais gerados usando MGR e métodos não-MGR revelou pouca variação de qualidade de difração entre cristais crescidos usando qualquer método, embora autores anteriores relataram que os cristais de boa qualidade são m...

A partir de sua aplicação inicial por Perutz, Kendrew e colegas de trabalho na determinação das estruturas de hemoglobina e mioglobina, aos alto rendimento modernos pipelines automatizados da genômica estrutural consórcios, macromolecular cristalografia de raios-X nos proporcionou uma visão estrutural sem precedentes no mundo da proteína . Esta técnica continua sendo o método experimental mais amplamente aplicável, que permite a visualização direta da estrutura da proteína em atômica, ou perto de resolução atômica (ou seja, no intervalo a 1-3). Um pré-requisito para a difracção de raios-X para ser aplicado a uma proteína é que ele deve primeiro ser cristalizado, e é esta fase do processo, que continua a ser o maior única etapa limitante da velocidade na determinação da estrutura por meio de métodos de difracção de 1, 2. Apesar dos avanços significativos em nossa compreensão do processo de cristalização de proteínas, e grandes melhorias na qualidade e disponibilidade de telas de cristalização,bandejas, e tecnologias relacionadas, permanece impossível prever com segurança a probabilidade de sucesso de cristalização 3. Métodos bioquímicos e biofísicos pode ser aplicado para avaliar se uma proteína de interesse apresenta características favoráveis ​​para a nucleação e crescimento de cristais, ou seja, é bem dobrada, homogêneo, monodispersa, etc, no entanto, essas idéias de forma alguma fornecer uma previsão definitiva de cristalização propensão. Sementeira tem sido suposto ser um método viável para aumentar o número, o tamanho e a qualidade dos cristais existentes ou material cristalino 4-7. Esta abordagem é baseada na premissa de que uma condição que suporta nucleação de cristais pode não ser ideal para o crescimento de cristais posterior e vice-versa. Por transferência de material nucleadas de uma condição para outra, pode-se tentar separar efetivamente esses processos, dando assim acesso, espaço novo cristalização ainda tão pouco explorado,e, como resultado do aumento da taxa de sucesso total de uma experiência de rastreio. Métodos estabelecidos foram documentadas para (i) macroseeding, a transferência de um único cristal na sua totalidade a partir de um estado para outro 8, (ii) sequência de semeadura, a transferência de material em núcleos, geralmente obtidos através da aplicação de pressão, por exemplo, usando direccional suiça de um gato para a superfície de um cristal existente, seguido pela passagem subsequente do suiça através de uma nova gota cristalização 9, e (iii) microdispersão &quot;clássica&quot;, a transferência de cristais &quot;sementes&quot;, gerados pela colheita esmagado cristais (ou cristalino material), em condições semelhantes às que produziram as sementes 10. Notavelmente todos esses três métodos são demorados e pouco escalável, certamente em comparação com o que é possível com modernos robótica cristalização manipulação de líquidos. Esses fatores têm contribuído, em algum nível, pelo menos, para a percepção de que as sementesing é um método único para ser visitado quando outras abordagens falharam a dar frutos. Aleatório matriz microdispersão (MGR) é uma inovação metodológica recente que combina os benefícios da microdispersão tradicional com os de rastreio de alto rendimento e escalabilidade 11-13. Esta abordagem baseia-se na geração de um stock de sementes, produzido a partir de material cristalino nucleada, que podem ser divididas em alíquotas para / em cada sub-well/coverslip dentro de uma tela de cristalização de 96 condição padrão. Este método é aplicável tanto sentado ou pendurado experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 24 poços ou formato de tabuleiro de 96 poços. MGR foi demonstrada experimentalmente para aumentar significativamente a taxa de sucesso de cristalização, e produzir cristais de melhor qualidade e maior quantidade de 11, 13, 14 de difracção, e representa uma ferramenta inovadora no arsenal dos cristalógrafos de abordagens no oNgoing esforço para o sucesso de cristalização. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR e fornecer dados de exemplo que ilustram a eficácia desta técnica.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

Rastreio aleatório matriz microseed (MGR) é uma técnica de cristalização de proteínas, em que os cristais de semente são adicionados às telas aleatórios. Ao aumentar a probabilidade de que os cristais vai crescer na zona metaestável do diagrama de fases de uma proteína, leva cristalização extras são muitas vezes obtidos, a qualidade dos cristais produzidos poderá ser aumentado, e uma boa oferta de cristais para coleta de dados e experiências de imersão é fornecido. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR que podem ser aplicadas a qualquer sentados gota ou pendurados experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 96 poços ou formato de tabuleiro de 24 poços.

(A) Exemplo de um experimento MGR Para demonstrar a eficácia do rastreio MGR aplicamos este método para a cristalização de galinha lisozima de ovo branco (HEWL) e fígado bovino catalase (BLC). Ambos estes enzimas são eminentemente cristalizável e são estruturalmente alvos 15, 16, bem caracterizados. Como tal, tanto fornecer assuntos de teste excelentes com as quais ilustram a taxa de sucesso reforçada cristalização alcançável com MGR. Experimentos de cristalização fora...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Aqui nós descrevemos um método geral para triagem aleatória matriz microseed. Esta técnica é mostrado para aumentar significativamente a taxa de sucesso de proteína de cristalização experimentos de triagem, reduzir a necessidade de otimização, e fornecer um suprimento confiável de cristais para a coleta de dados e experimentos ligante de imersão.

Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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