Name: surface passivation for single-molecule protein studies
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies at JoVE.com

وتم دعم مركز إيداع الأوراق المالية، منظمة العمل ضد الجوع، وCJ بواسطة بدءا المنح (ERC-جنيها استرلينيا-2012-309509) من خلال مجلس البحوث الأوروبي. وأيد J.-MN من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث (جبهة الخلاص الوطني) (2011-0018198) كوريا؛ وبرنامج مركز البحوث بايونير (2012-009586) من خلال جبهة الخلاص الوطني من كوريا بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتخطيط المستقبلي (MSIP). وأيد هذا العمل أيضا من قبل مركز BioNano الصحية الممولة من قبل الحرس MSIP كوريا باسم مشروع الحدود العالمية (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). وتم دعم YKL وJ.-HH من قبل برنامج زمالة العلوم سيول مدينة سيول، كوريا. كان البروتين المسمى معدل تقييم هدية سخية من الدكتور سوا ميونغ.

<ol>
	<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfaces+and+orientations:+much+to+FRET+about.">Surfaces and orientations: much to FRET about.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).</li><li>Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+FRET+of+protein-nucleic+acid+and+protein-protein+complexes:+surface+passivation+and+immobilization.">Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization.</a> Methods. 52 (2), 192-200 (2010).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+system+for+single+molecule+fluorescence+measurements+of+surface-immobilized+biomolecules.">Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules.</a> J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).</li><li>Kingshott, P., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+that+resist+biodegradation.">Surface that resist biodegradation.</a> Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).</li><li>Elbert, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+treatments+of+polymers+for+biocompatibility.">Surface treatments of polymers for biocompatibility.</a> Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).</li><li>Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).</li><li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2007).</li><li>Finkelstein, I. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+lipid+bilayers+and+DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+studies.">Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies.</a> Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).</li><li>Kenausis, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene+glycol)+layers+on+metal+oxide+surfaces:+attachment+mechanism+and+effects+of+polymer+architecture+on+resistance+to+protein+adsorption.">Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption.</a> J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).</li><li>Groll, J., Star Moeller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=polymer+surface+passivation+for+single-molecule+detection.">polymer surface passivation for single-molecule detection.</a> Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).</li><li>Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polyethylene+glycol+coatings+of+uptake+of+indocyanine+green+loaded+nanocapsules+by+human+spleen+macrophages+in+vitro.">Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro.</a> J Biomed Opt. 16 (5), (2011).</li><li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay.">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> J Vis Exp. (37), e1689 (2010).</li><li>Upadhyayula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coatings+of+polyethylene+glycol+for+suppressing+adhesion+between+solid+microspheres+and+flat+surfaces.">Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces.</a> Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).</li><li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level:+introducing+the+tools+and+applications.">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).</li><li>Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bringing+single-molecule+spectroscopy+to+macromolecular+protein+complexes.">Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes.</a> Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).</li><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+force+spectroscopy:+optical+tweezers,+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy.">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li><li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings.">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

خطوات حاسمة في هذا البروتوكول فمن الضروري لجعل ماء السطح قبل رد الفعل الأمينية silanization. وقد تحقق ذلك من خلال النقش الذي يولد سمكة البيرانا مجموعات الهيدروكسيل الحرة على سطح الزجاج / الكوارتز. فمن المستحسن عدم الحفاظ على سطح محفورا سمكة البيرانا يتعرض إما H 2 O أو الهواء لفترة طويلة من الزمن منذ hydrophilicity من السطح وتنخفض تدريجيا. جزيئات NHS استر PEG هي رد الفعل. ينصح لجعل مأخوذة وتخزينها تحت النيتروجين في -20 درجة مئوية. حياة الرف المادة الكيميائية APTES في درجة حرارة الغرفة قصيرة. ينصح ليحل محله مع واحدة جديدة كل شهر. إدخال تعديلات على هذا البروتوكول عندما لا يمكنك استخدام الحفر سمكة البيرانا لأي سبب من الأسباب العملية، قد حفر باستخدام KOH لفترة طويلة من الزمن (مثل سvernight)، الأمر الذي سيجعل أيضا مجموعات الهيدروكسيل عرضة للخطر. في شرك هذا النهج البديل هو أن يصبح غير قابل للاستخدام الشريحة بعد عدة بتدوير بسبب الخدوش شديدة. وغالبا ما تمارس لحرق سطح الزجاج / الكوارتز باستخدام الشعلة البروبان، وهو فعال في القضاء على المواد العضوية الفلورسنت 7. لم يتم تضمين هذا الإجراء في هذا البروتوكول لأنه لا لزوم لالنقش سمكة البيرانا. لاحظ أن هذا الإجراء سوف تؤدي إلى أكسدة مجموعات الهيدروكسيل. لذلك، لا ينبغي أن يتم هذا الإجراء مرة واحدة كان محفورا على السطح باستخدام KOH أو حل سمكة البيرانا. عند استخدام العازلة مع الرقم الهيدروجيني أقل من 7 لتصوير واحدة جزيء، والتشكل من PEG يتغير من &quot;الفطر&quot; إلى &quot;فرشاة&quot;، مما يقلل من درجة التخميل. لذلك، عندما يتم استخدام الرقم الهيدروجيني أقل من 7.0، فمن المستحسن لمزيد إيقاف فاعلية السطح باستخدام disuccinimidyl tartarate &lt;سوب&gt; 7. وجهات نظر وقد قدمت هذا العمل بروتوكول قوية لتحقيق جودة عالية التخميل السطح. وهذا البروتوكول يكون من المفيد للدراسات مضان واحدة جزيء التي تشارك مع البروتينات 14 وكذلك المجمعات البروتين داخل الخلايا ومقتطفات immunoprecipitates 15. سيتم استخدامه على نطاق واسع لغيرها من تقنيات جزيء واحد مثل التحليل الطيفي القوة وعزم الدوران الطيفي 16. وسوف يكون من المفيد أيضا لمنع الخلايا من التكثيف على السطح 17. بروتوكول المنصوص عليه في هذا العمل وتطالب لإجراءات متعددة الخطوات الخاصة به. التخميل السطح باستخدام الدهون PEG-8 وبولي يسين PEG 9 تتوفر كنهج بديل. منذ ذلك الحين، أنها لا تتطلب أي التفاعلات الكيميائية فمن السهل لتنفيذ. ومع ذلك، فإن درجة التخميل ليست عالية كما أن يتحقق من خلال modif الكيميائيةication من السطح.

عند إجراء دراسة واحدة جزيء البروتين الضروري لتحقيق نوعية عالية من التخميل السطح بحيث التجربة خالية من أي الناجم عن سطح البروتين عطل أو تمسخ 1،2. في حين أن سطح الزجاج تعامل مع السطحي، مثل ألبومين المصل البقري، ويستخدم عادة لواحدة جزيء الحمض النووي الدراسات 3، ودرجة التخميل ليست عالية بما فيه الكفاية لدراسات البروتين. سطح الزجاج المطلي مع البوليمر (غليكول البولي إثيلين، PEG) متفوقة في الأداء التخميل 4-6. وبالتالي، فقد أصبح يستخدم عالميا لدراسات البروتين جزيء واحد من أي وقت مضى منذ أن تم عرضه لدراسة مضان واحدة جزيء 7-10. يتطلب إجراء طلاء البوليمر المعالجات السطحية متعددة 7،11،12. وبالتالي، فمن الصعب اتباع الإجراء بأكمله دون تعليمات مفصلة. في كثير من الأحيان درجة التخميل السطح يختلف اعتمادا على البروتوكول الأوليتبع ق. هنا نقدم بروتوكول قوية مع خطوة بخطوة التعليمات، التي من شأنها إزالة واحدة من العقبات الرئيسية لدراسات البروتين جزيء واحد. انظر الشكل 1 لمحة عامة.

<table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" width="662">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1. Slide preparation and cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0136 631-0144 631-0147</td>
			<td>24x32mm2, 22x40mm2, 
			24x50mm2 &#160;(No.1&#189;, 
			Rectangular)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond drill bits</td>
			<td>MTN-Giethoorn, The Netherlands</td>
			<td>LA-0564-00DB</td>
			<td>3/4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass staining dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>300101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O2</td>
			<td>Boom</td>
			<td>6233905</td>
			<td>Opened bottles should be stored at 4 &#176;C. 
			1 L, hydrogen peroxide 30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2SO4</td>
			<td>Boom</td>
			<td>80900627.9010</td>
			<td>Sulfuric acid 95-98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quartz slides</td>
			<td>Finkenbeiner</td>
			<td></td>
			<td>1&#8221; x 3&#8221;, 1 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2. Coverslip cleaning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran slide holder</td>
			<td>LGS, The Netherlands</td>
			<td>213170003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30603</td>
			<td>Potassium hydroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3. Amino-silanization of slides and coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>320099-500ML</td>
			<td>Acetic acid, glacial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td>Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 
			3-aminopropyl trimethoxysilane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask (200mL)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Flask (200 mL)</td>
			<td>Have one flask dedicated for aminosilanization. 
			Pyrex flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32213</td>
			<td>1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td></td>
			<td>Tabletop ultrasonic cleaner, 3510</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4. Surface passivation using polymer (the first round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td>
			<td>Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&#160;Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>MPEG-SVA-5000-1g</td>
			<td>Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 &#176;C under N2. 
			mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6. Surface passivation (the second round)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8418-100ML</td>
			<td>Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, &#8805;99.9%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DST</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>20589</td>
			<td>Disuccinimidyl tartarate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS4-PEG</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>22341</td>
			<td>Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 &#176;C. 
			Short NHS-ester PEG, MW 333 Da</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7. Assembling a microfluidic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double sticky tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td>10mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>G14250</td>
			<td>Devcon 5 minute epoxy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1 KG</td>
			<td>Sodium chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutravidin</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>31000</td>
			<td>Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 &#176;C. 
			ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S-888</td>
			<td>Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503-1 KG</td>
			<td>Tris</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface passivation for single-molecule protein studies

وقد ثبت جزيء واحد مضان الطيفي ليكون مفيدا في فهم مجموعة واسعة من الظواهر البيولوجية في النانومترية الحجم. أمثلة هامة لما يمكن أن تسفر هذه التقنية إلى العلوم البيولوجية هي رؤى الآلية على البروتين البروتين والحمض النووي البروتين التفاعلات. عندما يتم بحثها تفاعلات البروتينات في مستوى واحد جزيء، كثيرا ما يجمد البروتينات أو ركائز على سطح الزجاج، والذي يسمح لمراقبة طويلة الأجل. هذا المخطط الشلل قد يعرض القطع الأثرية السطح غير المرغوب فيها. وبالتالي، فمن الضروري إيقاف فاعلية سطح الزجاج لجعلها خاملة. طلاء السطح باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG) تبرز لأداء عالية في منع البروتينات من التفاعل غير تحديدا مع سطح الزجاج. ومع ذلك، فإن الإجراء طلاء البوليمر أمر صعب، بسبب المضاعفات الناجمة عن سلسلة من المعالجات السطحية والمتطلبات الصارمة التي تحتاج الى السطح لأن تكون خالية من أي جزيئات الفلورسنت في نهاية الإجراء. هنا، ونحن نقدم بروتوكول قوية مع خطوة بخطوة التعليمات. وهو يغطي تنظيف السطح بما في ذلك النقش سمكة البيرانا، functionalization السطح مع مجموعات أمين، وأخيرا PEG الطلاء. للحصول على كثافة عالية من طبقة PEG، ونحن نقدم استراتيجية جديدة لعلاج السطح مع الجزيئات PEG على جولتين، مما يحسن بشكل ملحوظ نوعية التخميل. نحن نقدم نتائج ممثل وكذلك نصائح عملية لكل خطوة حاسمة بحيث يمكن لأي شخص تحقيق جودة عالية التخميل السطح.

بعد التجمع غرفة ميكروفلويديك (الخطوة 7،1-7،6) وقبل تنفيذ الخطوة 7.7، وينصح لتنفيذ مراقبة الجودة لسطح مضاد للفيروسات. إذا كان قد تم الانتهاء من التخميل السطح بنجاح، وهناك أقل من 10 كثف غير تحديدا البروتينات في منطقة التصوير (25 ملم × 25 ملم) لاحظ عند إضافة 1-10 نانومتر البروتين fluorescently المسمى في غرفة (الشكل 3A، يسار). عندما لم يتم تنفيذ أي من التنظيف أو رد فعل من الخطوات بشكل صحيح، وعدد من غير وجه التحديد كثف البروتينات تزيد بدرجة كبيرة، وشاشة CCD قد تكون مشبعة بواسطة إشارات مضان. على سبيل المثال، إذا تم تخطي الحفر سمكة البيرانا، هناك 100 مرة كمية أكبر من الامتزاز غير محددة لاحظ (الشكل 3A، مقارنة مع ترك وسط). عندما يتم تخطي الخطوة الثانية من مضاد، كان هناك ما يقرب من 3 مراتسا كمية أكبر من الامتزاز وحظ غير محددة (الشكل 3B). ويلاحظ وجود انخفاض درجة من مضاد عند استخدام المواد الكيميائية منتهية الصلاحية (على سبيل المثال APTES تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر) (لا تظهر البيانات). نوعية سطح قطرات أيضا أسفل عندما قدرا كبيرا من الوقت قد مرت منذ كان مضاد للفيروسات (الشكل 3A؛ مقارنة مع ترك الحق). لمعرفة أفضل لنا، هذه هي المرة الأولى التي يتم تقديمها جولتي من مضاد للدراسات جزيء واحد. جولتين من من مضاد ضمان أعلى جودة PEG طبقة تشكيل (الشكل 3B). يظهر طبيعة متفوقة من من مضاد مزدوجة بارز في الأفلام (مقارنة مع فيلم 1A 1B السينما). في هذه الأفلام، ويلاحظ الإشارات الخلفية من جزيئات الفلورسنت في حل أن يكون أضعف بكثير عندما كان من مضاد مزدوجة<html> المستخدمة، والتي تشير إلى أن البروتينات وصدت أكثر فعالية من قبل طبقة مضاد للفيروسات على نحو مضاعف. على الرغم من ينصح هذه العملية من خطوتين بقوة، فإن الخطوة الثانية من مضاد قد يتم تخطي إذا كانت التجربة هو مقبول لالتخميل غير الأمثل. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1: رسم تخطيطي للالمعالجات السطحية (أ) يتم تنظيف شريحة المجهر مع الأسيتون، كوه، والحلول سمكة البيرانا. ومن بين functionalized مع APTES ومضاد للفيروسات مع NHS استر PEG. (ب) يتم تنظيف ساترة مع KOH، وكذلك مع حل سمكة البيرانا إذا لزم الأمر. ومن بين functionalized مع APTES ومضاد للفيروسات مع NHS استر PEG. fig2highres.jpg &quot;العرض =&quot; 500 &quot;/&gt; الشكل 2: غرفة ميكروفلويديك (أ) غرفة على قناة واحدة. الشريحة المجهر لديه اثنين من الثقوب المحفورة. يتم تجميعها مع ساترة باستخدام شريحتين من شريط لاصق على الوجهين. (ب) غرفة ثلاث قنوات. الشريحة المجهر لديه ستة ثقوب حفرت. يتم تجميعها مع ساترة باستخدام أربع شرائح من شريط لاصق على الوجهين. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> الشكل 3: صور CCD اتخذت مع البروتينات المسمى الصبغة في الحل. (أ) وقد أخذت صور CCD بواسطة نوع المنشور مجموع مضان انعكاس داخلي المجهري باستخدام عدسة الهدف 60X مع 10 نانومتر CY3-labeld معدل تقييم في الحل. وقد أعد (يسار) سطح بعد بروتوكول في هذه المقالة. (الأوسط) وكان سطح استعداداتتم تخطي الحمراء بعد بروتوكول في هذه المقالة، ولكن سمكة البيرانا النقش. (يمين) وأعد السطح بعد بروتوكول في هذه المادة وتخزينها لمدة 3 أشهر عند درجة حرارة -20 º C تحت النيتروجين. (ب) وصور CCD اتخذت مع 10 نانومتر CY3-labeld معدل تقييم في الحل. وقد أعد (يسار) سطح بعد بروتوكول في هذه المقالة. (يمين) وأعد السطح بعد بروتوكول في هذه المقالة، ولكن تم تخطي الدور الثاني من من مضاد. شريط النطاق = 5 ميكرون. الفيلم 1: الأفلام CCD اتخذت مع البروتينات المسمى الصبغة في الحل. أخذت الأفلام CCD بواسطة نوع المنشور مجموع مضان المجهري التأمل الداخلي باستخدام عدسة الهدف 60X مع 10 نانومتر CY3-labeld معدل تقييم في الحل. القرار الوقت هو 100 ميللي ثانية. (أ) تم إعداد السطح بعد بروتوكول في هذه المقالة. (ب) وقد تم إعداد السطح بعد بروتوكول في هذه المقالة، ولكن الجولة الثانية من PEGylتم تخطي أوجه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">اضغط هنا</a> لمشاهدة الفيلم و1A <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">انقر هنا</a> لعرض فيلم 1B.

Watch this Scientific Journal Video about Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies at JoVE.com

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

نحن تصف طريقة لتخميل سطح الزجاج باستخدام البولي ايثيلين جلايكول (PEG). هذا البروتوكول يشمل تنظيف السطح، functionalization السطح، وPEG الطلاء. ونحن نقدم استراتيجية جديدة لعلاج السطح مع الجزيئات PEG على جولتين، والتي ينتج نوعية متفوقة من التخميل بالمقارنة مع الطرق القائمة.

التخميل السطح للدراسات البروتين جزيء واحدة

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

إنتاج ثاني كبريتيد استقرت مجمعات الببتيد عبر الغشاء الدراسات الإنشائية

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Transport of Surface-modified Carbon Nanotubes through a Soil Column

النقل من أنابيب الكربون النانوية المعدلة السطح من خلال عمود التربة

Carbon nanotubes (CNTs) are widely manufactured nanoparticles, which are being utilized in a number of consumer products, such as sporting goods, ...

A Method to Manipulate Surface Tension of a Liquid Metal via Surface Oxidation and Reduction

A طريقة لمعالجة التوتر السطحي من المعدن السائل عن طريق الأكسدة السطحية والحد من

Controlling interfacial tension is an effective method for manipulating the shape, position, and flow of fluids at sub-millimeter length scales, where ...

CN-GELFrEE - Clear Native Gel-eluted Liquid Fraction Entrapment Electrophoresis

CN-GELFrEE - واضح الأصلية جل مزال-جزء السائل الفخ الكهربائي

Protein complexes perform an array of crucial cellular functions. Elucidating their non-covalent interactions and dynamics is paramount for understanding ...

Synthesis of Cyclic Polymers and Characterization of Their Diffusive Motion in the Melt State at the Single Molecule Level

توليف دوري البوليمرات وتوصيف تلك الحركة ناشر في الدولة تذوب في واحدة جزيء مستوى

We demonstrate a method for the synthesis of cyclic polymers and a protocol for characterizing their diffusive motion in a melt state at the single ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

نظرة ثاقبة لتفاعلات الأحماض الأمينية والببتيدات مع المواد غير العضوية عن طريق جزيء واحدة قوة التحليل الطيفي

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Preparation of Stable Bicyclic Aziridinium Ions and Their Ring-Opening for the Synthesis of Azaheterocycles

إعداد أيونات أزيريدينيوم تربين مستقرة وعلى فتح الحلقة لتوليف أزاهيتيروسيكليس

Bicyclic aziridinium ions were generated by the removal of an appropriate leaving group through internal nucleophilic attack by nitrogen atom in the ...

Surface Functionalization of Metal-Organic Frameworks for Improved Moisture Resistance

الروغان السطحية من الأطر المعدنية العضوية لمقاومة الرطوبة محسنة

Metal-organic frameworks (MOFs) are a class of porous inorganic materials with promising properties in gas storage and separation, catalysis and sensing. ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

خصائص سطح المركبة نانوبوروس الكربون ومصفوفات السليكا

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...