Name: examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities
Uploaded: 2014-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Forfatterne takker medlemmerne af Harata laboratorium til nyttige diskussioner hele udførelsen af ​​dette arbejde. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra American Heart Association, dystoni Medical Research Foundation, Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, National Science Foundation, og Whitehall Foundation til NCH

1.. Primær kultur af neuroner fra pattedyrs hjerne Alle animalske procedurer udført i denne undersøgelse er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Iowa. <ol><li> Forbered dissocierede cellekultur af CA3-CA1 regioner af hippocampus fra mus eller rotter på postnatal dag 0-1 19,20. Plate hippocampus celler på 12-mm dækglas (tykkelse nummer 0) preseeded med rotte gliale fødelag i skåle med 24 brønde, og ved en densitet på 12.000 celler / brønd....

Vi har beskrevet protokoller for farvning og affarvning synaptiske vesikler som reaktion på fremkaldte, spontan og miniature synaptisk aktivitet og for billedbehandling i Affarvningsopløsningen fase. I tillæg til de eksisterende protokoller, har vi inkluderet en ny protokol for at observere FM affarvning baseret på miniature synaptisk aktivitet. Ved hjælp af disse protokoller, vi tidligere identificeret abnormiteter i dyrkede neuroner fra en musemodel af bevægelsen uorden dystoni. I forhold til deres kolleger i wi...

Funktionaliteten af ​​synaptiske vesikler er en vigtig faktor for synaptisk transmission. Disse vesikler frigiver neurotransmittere, når de smelter med den præsynaptiske plasmamembran (exocytose), og de bliver klar til endnu en cyklus af frigivelse efter bliver regenereret fra plasmamembranen (endocytose) og genindlæses med neurotransmitter. Forskning i dynamik og mekanismerne bag synaptisk vesikel genbrug er blevet stærkt fremskyndet af indførelsen af styryl FM farvestoffer 1. Disse amfipatiske molekyler, som har positivt ladede hydrofile hoved grupper og hydrofobe haler (flere farvestoffer i figur 1A, stereoview af FM1-43 i figur 1B), kan reversibelt ind og ud lipidmembraner uden gennemtrænger dem. Grupper af FM farvestoffer deler lignende funktioner, der påvirker den række af lys, de udsender. For eksempel, FM2-10, FM1-43, og FM1-84 har en dobbeltbinding mellem to cykliske forbindelser og show grøn emission. Forskellen mellem dem er længden af ​​den hydrofobe hale, som bestemmer dens hydrofobicitet og dermed hastigheden af ​​exit fra membranen (departitioning). I tilfælde af FM5-95 og FM4-64, tre dobbeltbindinger knytte de cykliske forbindelser, og de viser rød emission. Disse farvestoffer er forskellige med hensyn til deres hydrofile dele. I alle FM farvestoffer fluorescensintensiteten øges, når de indsættes i biologiske membraner, som følge af en stigning i kvanteudbytte i den hydrofobe miljø i forhold til det hydrofile miljø. Således ændringerne i FM intensitet repræsenterer ændringerne i omsætning membran. De forskellige farver (emission spektre) og hydrofobiciteter gøre FM farvestoffer en alsidig forskning værktøj i synaptisk vesikel genbrug. Baseret på disse funktioner, er FM-farvestoffer oftest anvendes i henhold til følgende skema, når man analyserer synaptiske vesikel genbrug (figur 2). Neurons er badet i en ekstracellulær opløsning indeholdende FM farvestof, der gør det muligt at blive taget op i synaptiske vesikler (SVS), da de udgør via endocytose (farvning). Farvestoffet vaskes derefter ved at anvende et farvestof-fri ekstracellulære opløsning, hvilket afslører de funktionelle nerveender, nemlig kun de aktivt undergår endocytose vil indeholde en klynge af synaptiske vesikler, der er fyldt med farvestoffet (figur 2 nederst). Efter exocytose fører til tab af FM-farvestoffet til det ekstracellulære rum og et ledsagende tab af fluorescens (affarvning, skyldes både departitioning til et hydrofilt miljø og diffusion væk fra stedet for exocytose). Derfor ændringerne i FM fluorescensintensitet er indikatorer for synaptisk vesikel exo-og endocytose. FM-farvestoffer er blevet brugt til at farve og affarves de synaptiske vesikler i forskellige organismer og præparater 2,3. Som eksempler kan nævnes pattedyr NEUROnal kulturer 4-9, pattedyr hjernen skiver 10,11, neuromuskulære junctions 12,13, nethinde bipolære neuroner 14,15, og hår celler i cochlea 16. Typisk i sådanne forsøg er både farvning og affarvning udløst af ekstensivt stimulere neuroner (fremkaldt aktivitet). For nylig, dog synaptiske vesikel genbrug reaktion på svag stimulation er også blevet analyseret, som har genbrug i mangel af en ekstern stimulus (spontan og miniature synaptisk aktivitet) 9,17-19. Spontane og miniature synaptiske Aktiviteterne er defineret som dem, der forekommer i fravær af eksterne stimuli, med den tidligere involverer spontan fyring af aktionspotentialer (Figur 3). Disse svage synaptiske aktiviteter er forbundet med mindre ændringer i FM-signaler end dem, udløst af omfattende stimulering. Målingen kræver, at ændringerne i FM fluorescerning intensitet præcist afspejler synaptiske vesikel exocytose eller endocytose, men ikke kunstig ændringer i intensitet. En årsag til artefakt er tilstedeværelsen af ​​ikke-specifik farvning af plasmamembranen ved hjælp af FM-farvestoffer. Gradvis udvaskning af denne komponent vil føre til en gradvis ændring i den målte fluorescensintensitet, som vil blive fejlagtigt tilskrives synaptiske aktiviteter. Denne faktor kan reduceres ved passende metoder (se protokollen). Det mest bemærkelsesværdige årsag til artefakt er fotoblegning FM farvestof holdes inden synaptiske vesikler. Fotoblegning-relaterede ændringer i FM intensitet skal være lille i forhold til de biologiske (synaptic) ændringer, der måles. Den seneste udvikling af følsomme kameraer, f.eks elektrontiltrækkende multiplicere ladningskoblet indretning (EMCCD) kamera, der gør det muligt at minimere fotoblegning ved at forkorte eksponeringstid og svække intensiteten af lys anvendes til at excitere fluoroforen. En anden årsag til den artefakt er et skred in fokusering lysniveau mikroskop. Fokus drift under et billeddannende session kan være forårsaget af mekaniske eller termiske virkninger og vil fejlagtigt føre til en ændring i den målte fluorescensintensitet. Her beskriver vi protokoller og udstyr, der gør det muligt at bruge FM farvestoffer til at analysere synaptiske vesikel genvinding, selv i forbindelse med svage eller ingen stimulation, især miniature synaptisk aktivitet. Vi viser eksempler på farvning og affarvning af vesikler under evoked og spontane synaptiske begivenheder, ved hjælp af dyrkede gnaver hippocampus neuroner, og billeddannelse Affarvningstrinnet fase. Vi viser også, hvordan man vurderer graden af ​​FM farvestof fotoblegning, i mangel af enhver FM farvestof tab på grund af synaptiske aktiviteter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1767">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pulse generator</td>
			<td>AMPI</td>
			<td>Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolated stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>DS3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>This is used for assessing the cell morphology at low magnification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TiE</td>
			<td>This is used for high-resolution fluorescence and transmitted light imaging, with minimal focus drift.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Water-immersion lens is recommended. Oil-immersion lens is usable unless an imaged structure is deep from the coverslip surface (e.g. &#62;10 &#956;m).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em for FM1-43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>490/20-nm ex, 510-nm dclp, 650-nm-LP em for FM4-64.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMCCD camera</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>iXon EM+ DU-860</td>
			<td>This EMCCD camera is used for high-sensitivity detection of fluorescence.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid recirculating chiller</td>
			<td>Solid State Cooling Systems</td>
			<td>Oasis 160</td>
			<td>This is used for continuously perfusing the camera with chilled water for maintaining a temperature of -80&#176;C, and thereby reducing noise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>CoolLED-Custom Interconnect</td>
			<td>490 nm&#160;</td>
			<td>This light source is used for rapid on/off control of fluorescence excitation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition software</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td>Solis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging chamber</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-21BRFS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNQX</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-AP5</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>0106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrodotoxin</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1069</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM1-43</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T35356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM1-43 (FM1-43FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F35355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldehyde-fixable FM4-64 (FM4-64FX)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F34653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#8217; balanced salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum Essential Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>51200-038</td>
			<td>This solution does not contain phenol red that will interfere with fluorescence imaging.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: toxic reagent. Handle with care.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of synaptic vesicle recycling using fm dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities

Synaptiske vesikler i funktionelle nerveender gennemgå exocytose og endocytose. Denne synaptiske vesikel genanvendelse kan være effektivt analyseres ved hjælp styryl FM farvestoffer, som afslører omsætning membran. Konventionelle protokoller til anvendelse af FM farvestoffer blev designet til at analysere neuroner efter stimuleret (fremkaldt) synaptisk aktivitet. For nylig har protokoller bliver tilgængelige for at analysere FM-signaler, der ledsager svagere synaptiske aktiviteter, såsom spontane eller miniature synaptiske begivenheder. Analyse af disse små ændringer i FM-signaler kræver, at billeddannende system er tilstrækkelig følsom til at påvise små ændringer i intensitet, men at kunstig ændringer i stor amplitude undertrykkes. Her beskriver vi en protokol, som kan anvendes til fremkaldte, spontan, og miniature synaptiske aktiviteter og anvende dyrkede hippocampale neuroner som et eksempel. Denne protokol omfatter også et middel til at vurdere graden af ​​fotoblegning FM farvestoffer, da dette er en væsentligkilde af artefakter, når imaging små ændringer i intensitet.

Som et eksempel, viser vi repræsentative resultater Affarvningsopløsningen tidsforløbet af synaptiske vesikler (figur 4). Dyrkede hippocampale neuroner blev farvet med FM4-64 ved hjælp af spontan synaptisk aktivitet (trin 2.3) og vasket med farvestof-fri opløsning (skylleopløsning 2). De billeddannende viser den oprindelige affarvning tidsforløbet hjælp spontan aktivitet (trin 5.3) (indledende del af kontinuerlig linje, figur 4A). Dette er efterfulgt af affarvning tidsforløb un...

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities at JoVE.com

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Undersøgelse af synaptiske vesikel Genbrug Brug af FM Farvestoffer Under Evoked, spontan, og Miniature Synaptiske aktiviteter

Vi beskriver brugen af ​​styryl FM farvestoffer til billede synaptiske vesikel genbrug i funktionelle nerveender. Denne protokol kan anvendes ikke blot på fremkaldte, men også spontan og miniature synaptiske aktiviteter. Protokollen udvider forskellige synaptiske begivenheder, der effektivt kan evalueres.

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Cellular Processes

Membranes and Cellular Transport

SCIENTISTS IN ACTION

Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Kvantitativ analyse af Synaptic vesikel Pool Replenishment i dyrkede cerebellare Granule Neuroner bruger FM Farvestoffer

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion og exocytose af membranproteiner i dyrkede neuroner vurderes ved hjælp af Fluorescens Recovery og Fluorescens-tab fotoblegning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Fremstilling af Synaptic plasmamembranen og postsynaptiske Density Proteiner hjælp af en Diskontinuerlig sucrosegradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måling af Synaptic vesikel endocytose i kulturperler hippocampus neuroner

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Optagelse synaptisk plasticitet i akut hippocampus skiver vedligeholdes i en lille-volumen genanvendelse - Perfusion- og neddykning-type kammer System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Dyrkning af In Vivo-indkvartering Murine astrocytter ved hjælp af den hurtige, enkle og billige AWESAM protokol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole-induceret Kindling musemodel

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Ved at kombinere Optogenetics med kunstige MicroRNA at karakterisere effekter af genet Knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt Neuronal kredsløb

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...